[發明專利]一種靶向KIF20A陽性胰腺癌雙特異性抗體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201811302589.5
• 申請日: 2018-11-02
• 公開（公告）號: CN109400710A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 賈原;張俊萍;韓亞萍;郭繼強;王琳;李芳;王玉華
• 申請（專利權）人: 山西大醫院（山西醫學科學院）
• 主分類號: C07K16/46
• 分類號: C07K16/46;C07K16/30;C07K16/28;C07K1/34;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 太原申立德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 14115
• 代理人: 郭海燕

1.一種靶向KIF20A陽性胰腺癌雙特異性抗體，其特征是通過下述方法制備得到：

(1)選購Anit-CD3+，Anti-KIF20A單克隆抗體；

(2)取1mg人源CD3單克隆抗體，溶于0.3-0.6mM交聯劑Traut's試劑中，得到人源CD3單鏈抗體；

(3)取1mg人源KIF20A單克隆抗體，溶于0.3-0.6mM交聯劑Sulfo-SMCC中，得到人源KIF20A單鏈抗體；

(4)將步驟(2)的人源CD3單鏈抗體和步驟(3)的人源KIF20A單鏈抗體混合，室溫下經Sephrose-G25凝膠層析柱分離純化，取出多余的交聯劑，得到單鏈抗體；

(5)將步驟(4)純化得到的單鏈抗體立即裝入含有緩沖液的透析袋中混合，并于4℃下在緩沖液中透析作用18小時，得到雙抗體復合物；

(6)采用SDS-PAGE凝膠電泳鑒定步驟(5)得到的雙抗體復合物分子量，Sephrose-G25凝膠柱純化并超濾濃縮，得到雙特異性抗體復合物。

2.根據權利要求1所述的一種靶向KIF20A陽性胰腺癌雙特異性抗體，其特征是所述的Sephrose-G25凝膠層析柱平衡緩沖體系為20mMTris，100mMNaCl，pH7.3。

3.根據權利要求1所述的一種靶向KIF20A陽性胰腺癌雙特異性抗體，其特征是所述的透析袋孔徑大小為10kd。

4.根據權利要求1所述的一種靶向KIF20A陽性胰腺癌雙特異性抗體，其特征是所述的透析袋中緩沖液的組成為：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3。

5.權利要求1-4中任意一項所述的一種靶向KIF20A陽性胰腺癌雙特異性抗體的制備方法，其特征是包括以下步驟：

(1)選購Anit-CD3+，Anti-KIF20A單克隆抗體；

(2)取1mg人源CD3單克隆抗體，溶于0.3-0.6mM交聯劑Traut's試劑中，得到人源CD3單鏈抗體；

(3)取1mg人源KIF20A單克隆抗體，溶于0.3-0.6mM交聯劑Sulfo-SMCC中，得到人源KIF20A單鏈抗體；

(4)將步驟(2)的人源CD3單鏈抗體和步驟(3)的人源KIF20A單鏈抗體混合，室溫下經Sephrose-G25凝膠層析柱分離純化，取出多余的交聯劑，得到單鏈抗體；

(5)將步驟(4)純化得到的單鏈抗體立即裝入含有緩沖液的透析袋中混合，并于4℃下在緩沖液中透析作用18小時，得到雙抗體復合物；

(6)采用SDS-PAGE凝膠電泳鑒定步驟(5)得到的雙抗體復合物分子量，Sephrose-G25凝膠柱純化并超濾濃縮，得到雙特異性抗體復合物。

6.根據權利要求5所述的一種靶向KIF20A陽性胰腺癌雙特異性抗體的制備方法，其特征是所述的Sephrose-G25凝膠層析柱平衡緩沖體系為20mMTris，100mMNaCl，pH7.3。

7.根據權利要求5所述的一種靶向KIF20A陽性胰腺癌雙特異性抗體的制備方法，其特征是所述的透析袋孔徑大小為10kd。

8.根據權利要求5所述的一種靶向KIF20A陽性胰腺癌雙特異性抗體的制備方法，其特征是所述的透析袋中緩沖液的組成為：20mMTris，100mMNaCl,pH7.3。

9.權利要求1-4中任意一項所述的一種靶向KIF20A陽性胰腺癌雙特異性抗體的應用，其特征是用于治療胰腺癌。

10.根據權利要求9所述的一種靶向KIF20A陽性胰腺癌雙特異性抗體的應用，其特征是用于治療胰腺癌之前首選對非特異性DC-T細胞進行前處理，具體的處理方法包括以下步驟：

(1)抽取人體外周血，利用淋巴細胞分離液將單個核細胞PBMC進行分離1900-2300/min,離心10-20分鐘；

(2)PBMC細胞加30-50ml淋巴細胞培養液，過夜培養，第二天懸浮的細胞倒入另一個無菌細胞培養瓶中Tc1，貼壁細胞用于培養DC細胞Dc1；

(3)上述Dc1細胞培養過程中加入0.5-1.2mM維生素C，與Dc1混合培養3-5天；

(4)上述Tc1細胞加入CD3+單克隆抗體，700-1500U/ml白介素二(IL-2)，培養3-5天；

(5)將(1-3)與(1-4)細胞混合培養，利用(1-3)培養的Dc1細胞增強Tc1細胞，聯合培養5-9天；

(6)檢測T細胞亞群及細胞因子分泌能力，流式鑒定T細胞亞型及細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4分泌水平。