[發(fā)明專利]一種從基因工程水稻種子中分離純化低鐵飽和度的重組人乳鐵蛋白的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811299207.8
• 申請日: 2018-11-02
• 公開（公告）號: CN111138524B
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊代常;董亮亮
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢禾元生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K14/79
• 分類號: C07K14/79;C07K1/18;C07K1/34
• 代理公司: 北京律誠同業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

本發(fā)明的目的是提供一種從基因工程水稻種子中分離純化低鐵飽和度的重組人乳鐵蛋白(OsrhLF)的方法。首先從重組人乳鐵蛋白基因工程水稻種子中提取含有重組乳鐵蛋白的粗提取物，提取緩沖液包含50～100mM檸檬酸?檸檬酸三鈉、100～200mMNaCl，1～10mM?EDTA?2Na，pH為3.8～5.0；再將所得含有重組人乳鐵蛋白的粗提取物經(jīng)陽離子層析，獲得純度＞95％的低鐵飽和度乳鐵蛋白產(chǎn)品。本發(fā)明的另一目的是提供一種從基因工程水稻中種子中提取低鐵飽和度的重組人乳鐵蛋白(OsrhLF)的方法，使用的提取液含有檸檬酸?檸檬酸三鈉和EDTA?2Na，可顯著降低提取OsrhLF的鐵飽和度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從基因工程水稻種子中分離純化低鐵飽和度的重組人乳鐵蛋白的方法。

背景技術(shù)

乳鐵蛋白(LF)是一種非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，廣泛存在于哺乳動物的外分泌液中，是人體防止感染的第一道防線，具有廣譜抗菌作用，可以作用于細(xì)菌、真菌、原生動物、病毒。乳鐵蛋白主要有“鐵剝奪”、膜滲透、酶抑制及輔助抗菌等4種抑菌機(jī)制。(1)鐵剝奪機(jī)制。幾乎所有的細(xì)菌生長都需要鐵，鐵離子對細(xì)菌中的氧化酶是必須的。乳鐵蛋白作為一種鐵結(jié)合蛋白，可以與微生物競爭性的結(jié)合鐵離子，從而使得微生物失去賴以生存的鐵離子，進(jìn)而導(dǎo)致微生物的死亡。這種依賴于鐵的抑菌機(jī)制中，乳鐵蛋白的活性取決于鐵離子的飽和程度。一般來說，飽和度越低，抑菌活性越高。(2)膜滲透機(jī)制。乳鐵蛋白帶正電荷，與帶負(fù)電荷的磷脂、核酸和脂多糖具有很強(qiáng)的親和性，從而導(dǎo)致脂多糖的釋放，進(jìn)而破壞細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜。(3)酶抑制機(jī)制。研究表明，乳鐵蛋白對半胱氨酸蛋白酶有強(qiáng)烈的抑制作用，而半胱氨酸蛋白酶抑制劑可有效抑制金黃色葡萄球菌的生長。(4)輔助抗菌機(jī)制。乳鐵蛋白可以通過改變細(xì)菌與寄主之間的關(guān)系.從而間接達(dá)到抗菌作用。

鐵飽和度是乳鐵蛋白制品的一項(xiàng)關(guān)鍵性指標(biāo)，圍繞低鐵飽和度的乳鐵蛋白的提取和制備有許多相關(guān)研究。專利CN102459328A公開了一種制備低鐵飽和度的乳鐵蛋白的方法，該方法包括使用水混溶性溶劑和酸剝奪乳鐵蛋白的中的鐵，然后利用超濾或滲濾去除鐵、溶劑和酸，得到的乳鐵蛋白的鐵飽和度小于10％。其他一些關(guān)于降低乳鐵蛋白的鐵飽和度的研究結(jié)果涉及使用螯合劑和低pH環(huán)境來去除乳鐵蛋白中的鐵，但是得到的乳鐵蛋白鐵飽和度通常大于10％且不適宜商業(yè)化生產(chǎn)。

在專利《一種從水稻種子中分離純化重組人乳鐵蛋白的方法》(專利號:CN104109204B)中，我們介紹了一種從基因工程水稻中分離純化乳鐵蛋白的方法，但是該方法獲得乳鐵蛋白的鐵飽和度70％～80％，遠(yuǎn)高于正常母乳或牛乳中15％～20％的鐵飽和度。本發(fā)明是在上述專利的基礎(chǔ)上，針對鐵飽和度低的重組乳鐵蛋白的制備方法，通過對提取工藝及層析工藝研究，建立一種大規(guī)模、高效、工藝簡單地獲得低鐵飽和度乳鐵蛋白的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種從基因工程水稻種子中分離純化低鐵飽和度的重組人乳鐵蛋白(OsrhLF)的方法。

包括以下步驟：

1)從重組人乳鐵蛋白基因工程水稻種子中提取含有重組人乳鐵蛋白的粗提取物，提取緩沖液中含有50～100mM檸檬酸-檸檬酸三鈉、100～200mMNaCl，1～10mM?EDTA-2Na，pH為3.5～5.0；

2)將含有重組人乳鐵蛋白的粗提取物經(jīng)陽離子層析介質(zhì)，獲得純度＞95％的低飽和度乳鐵蛋白產(chǎn)品；

進(jìn)一步的上述方法包含以下步驟：

(1)將基因工程稻谷脫殼成半精米，研磨成80～100目的米粉。將米粉與提取緩沖液以1:5(重量/體積，kg/L)的比例混合，于15～35℃提取1～24小時(shí)。提取緩沖液的成分為：50～100mM檸檬酸-檸檬酸三鈉、100～200mMNaCl，10mM?EDTA-2Na，pH?3.8～5.0。將上述得到的混合物加入2～5％的珍珠巖進(jìn)行壓濾，壓濾完畢后，濾液用0.5～2M?NaOH或稀鹽酸調(diào)pH至4.0～5.0，0.22μm濾膜過濾后即為OsrhLF的粗提取物即陽離子層析的上樣液。