[發明專利]一種從基因工程水稻種子中分離純化低鐵飽和度的重組人乳鐵蛋白的方法

有效

• 申請號: 201811299207.8
• 申請日: 2018-11-02
• 公開（公告）號: CN111138524B
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 楊代常;董亮亮
• 申請（專利權）人: 武漢禾元生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K14/79
• 分類號: C07K14/79;C07K1/18;C07K1/34
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

1.一種從基因工程水稻種子中分離純化低鐵飽和度的重組人乳鐵蛋白的方法，依次包含以下步驟：

1)?從重組人乳鐵蛋白基因工程水稻種子中提取含有重組人乳鐵蛋白的粗提取物，提取緩沖液包含50~100mM檸檬酸-檸檬酸三鈉、100~200mMNaCl，1~10mM?EDTA-2Na，pH為3.5~5.0；

2)?將步驟1）所得含有重組人乳鐵蛋白的粗提取物經陽離子層析，獲得純度＞95%的低鐵飽和度人乳鐵蛋白。

2.根據權利要求1所述的方法，其中步驟?1)?所述重組人乳鐵蛋白粗提取物提取方法包括步驟：

i?)?將含有重組人乳鐵蛋白的基因工程稻米粉碎后與提取緩沖液按重量/體積比kg?/L=1:5混合，在15～35℃下提取1~24小時；

ii?)?將步驟i?)的提取混合物過濾后調節pH至4.0~5.0，獲得陽離子層析的上樣液。

3.根據權利要求1或2所述的方法，所述提取液pH為3.8~5.0。

4.根據權利要求1或2所述的方法，從重組人乳鐵蛋白基因工程水稻種子中提取含有重組人乳鐵蛋白的溫度為20~30℃。

5.根據權利要求1或2所述的方法，從重組人乳鐵蛋白基因工程水稻種子中提取含有重組人乳鐵蛋白的時間為5~24h。

6.根據權利要求1或2所述的方法，步驟2）中陽離子層析上樣液的pH為5.0。

7.根據權利要求1所述的方法，陽離子層析介質選擇使用SP?Bestarose?Big?Beads填料。

8.根據權利要求1或7所述的方法，所述步驟2）的層析方法為：

a）采用4~6倍柱體積的pH為4.0~5.0的含有50~150mM檸檬酸-檸檬酸三鈉、100~200mMNaCl，1~10mM?EDTA-2Na的緩沖液以200~300cm/h的線性流速平衡層析柱；

b）以步驟1）的粗提物為層析上樣液，其中上樣液pH為4.0~5.0、電導20~30mS/cm，上樣體積為20~40倍柱體積；

c）用pH為7.0~8.0的5~50mM?PB，300-500mMNaCl緩沖液，以200~300cm/h的線性流速進行洗脫雜蛋白，洗雜液體積為5~7倍柱體積；

d）用pH為7.0~8.0的5~50mM?PB，700~900?mMNaCl緩沖液，以200~300cm/h的線性流速進行洗脫重組人乳鐵蛋白，收集含有OsrhLF的洗脫液。

9.根據權利要求8所述的方法，層析上樣液的上樣量不超過30倍柱體積。

10.一種從基因工程水稻種子中提取低鐵飽和度的重組人乳鐵蛋白的方法，包括以下步驟：

（1）將基因工程稻谷脫殼成半精米，研磨成80~100目的米粉；

（2）將米粉與提取緩沖液以重量/體積kg/L?為1:5的比例混合，于15~35℃提取1~24小時，提取緩沖液的成分為250~100mM檸檬酸-檸檬酸三鈉、100~200mMNaCl，1~10mM?EDTA-2Na，pH為3.8~5.0；

（3）將上述步驟（2）得到的混合物加入2~5%的珍珠巖進行壓濾，得到含有重組人乳鐵蛋白的提取液。