[發明專利]類風濕關節炎大鼠炎癥因子qRT-PCR檢測標準曲線的建立方法

在審

• 申請號: 201811299171.3
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN109337968A
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發明（設計）人: 李振;郝慧琴;高玉亭;劉楊;王澤
• 申請（專利權）人: 山西中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及醫療技術領域，公開了類風濕關節炎大鼠炎癥因子qRT?PCR檢測標準曲線的建立方法，試驗材料包括36只Wistar雌性大鼠、基礎日糧、水、牛二型膠原以及甲氨蝶呤，建立方法包括以下步驟：試驗動物處理后進行引物設計及合成，依次進行RT?PCR擴增、測序、建立標準曲線以及進行結果分析。本發明以類風濕關節炎(CIA)大鼠為研究對象，通過引物設計、PCR擴增、克隆轉化等進行序列測定，并進行Blast比對，說明CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA mRNA水平檢測方法真實可靠，建立類風濕關節炎大鼠炎癥因子qRT?PCR檢測標準曲線，為后期研究其表達特性提供了準確的試驗依據。

技術領域

本發明涉及醫療技術領域，特別涉及類風濕關節炎大鼠炎癥因子qRT-PCR檢測標準曲線的建立方法。

背景技術

類風濕性關節炎(RA)被認為是一種慢性自身免疫性關節疾病，其特征為全身性炎癥，病因不明。全球大約0.5％-1％的成年人受到RA的影響。雖然疾病病因仍然未知，但研究滑膜中的各種炎性細胞(包括單核細胞/巨噬細胞、T細胞和B細胞、破骨細胞、樹突細胞、內皮細胞和滑膜成纖維細胞)有助于進一步了解RA的發生及發展。

Cdk1(周期素依賴激酶1)是Ser/Thr蛋白激酶家族的成員。Cdk1在控制真核細胞周期中發揮關鍵作用，其磷酸化和去磷酸化也在細胞周期控制中起重要的調節作用。CD3D參與免疫系統，易引起T細胞發育功能的缺陷。RALB(resorcylic acid lactone beta)是一種低分子量GTP結合蛋白，屬于onco蛋白的RAS家族。參與多種細胞過程，包括基因表達、細胞遷移、細胞增殖、致癌轉化和膜運輸。RelA是一種多效轉錄因子，存在于幾乎所有細胞類型中，是一系列信號轉導事件的終點，這些事件與炎癥、免疫、分化、細胞等許多生物過程相關。鑒于Cdk1、CD3D、RALB和RelA在調控炎癥反應中的重要作用。

發明內容

發明的目的在于提供類風濕關節炎大鼠炎癥因子qRT-PCR檢測標準曲線的建立方法，本發明以類風濕關節炎(CIA)大鼠為研究對象，通過引物設計、PCR擴增、克隆轉化等進行序列測定，并進行Blast比對，說明CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA mRNA水平檢測方法真實可靠，建立類風濕關節炎大鼠炎癥因子qRT-PCR檢測標準曲線，為后期研究其表達特性提供了準確的試驗依據，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

類風濕關節炎大鼠炎癥因子qRT-PCR檢測標準曲線的建立方法，試驗材料包括36只Wistar雌性大鼠、基礎日糧、水、牛二型膠原以及甲氨蝶呤，建立方法包括以下步驟：

S1：試驗動物的處理

選取36只42±2日齡健康狀況良好、Wistar雌性大鼠，根據每組間平均體重相近原則，隨機分為3個試驗組：I組，空白對照組(n＝12)：飼喂基礎日糧+水；II組，模型CIA組(n＝12)：多點皮下注射牛二型膠原；III組，陽性對照組(n＝12)，造模成功后，甲氨蝶呤按0.9mg/kg腹腔注射，1周1次；試驗結束后，麻醉、殺檢、腹主動脈取血備用；采集3個不同試驗組Wistar雌性大鼠脾臟相同部位，放入DEPC水處理過的EP管，迅速置于液氮中保存；

S2：引物設計及合成

根據NCBI網站提供的參考序列，使用Primer 5.0軟件設計4對特異性引物，用于完整CDS區測定，并進行合成；

S3：RT-PCR擴增

PCR反應體系：正反向引物各0.6μL，cDNA模板0.8μL，ddH₂O 5.5μL，2×Es TaqMaster Mix7.5μL，共15μL；擴增程序：94℃ 3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，35個循環；72℃ 5min，產物經3％瓊脂糖凝膠電泳檢測；