[發明專利]類風濕關節炎大鼠炎癥因子qRT-PCR檢測標準曲線的建立方法

在審

• 申請號: 201811299171.3
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN109337968A
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發明（設計）人: 李振;郝慧琴;高玉亭;劉楊;王澤
• 申請（專利權）人: 山西中醫藥大學
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.類風濕關節炎大鼠炎癥因子qRT-PCR檢測標準曲線的建立方法，其特征在于，試驗材料包括36只Wistar雌性大鼠、基礎日糧、水、牛二型膠原以及甲氨蝶呤，建立方法包括以下步驟：

S1：試驗動物的處理

選取36只42±2日齡健康狀況良好、Wistar雌性大鼠，根據每組間平均體重相近原則，隨機分為3個試驗組：I組，空白對照組(n＝12)：飼喂基礎日糧+水；II組，模型CIA組(n＝12)：多點皮下注射牛二型膠原；III組，陽性對照組(n＝12)，造模成功后，甲氨蝶呤按0.9mg/kg腹腔注射，1周1次；試驗結束后，麻醉、殺檢、腹主動脈取血備用；采集3個不同試驗組Wistar雌性大鼠脾臟相同部位，放入DEPC水處理過的EP管，迅速置于液氮中保存；

S2：引物設計及合成

根據NCBI網站提供的參考序列，使用Primer 5.0軟件設計4對特異性引物，用于完整CDS區測定，并進行合成；

S3：RT-PCR擴增

PCR反應體系：正反向引物各0.6μL，cDNA模板0.8μL，ddH₂O 5.5μL，2×Es Taq MasterMix7.5μL，共15μL；擴增程序：94℃ 3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，35個循環；72℃5min，產物經3％瓊脂糖凝膠電泳檢測；

S4：測序

將回收出來的DNA片段連接至T3-Cloing-Vector，PCR儀25℃恒溫10min，使連接產物與感受態細胞融合，37℃過夜培養，待LB固體培養基長出藍白斑，挑取白色單菌落，LB液體培養基培養12-16h，菌液進行測序；

S5：標準曲線的建立

將反轉錄后的CIA大鼠cDNA模板按照10×稀釋8個梯度，制備梯度標準品，每個PCR反應體系中起始模板濃度分別是：1.0、10×10^-1、1.0×10^-2、1.0×10^-3、1.0×10^-4、1.0×10^-5、1.0×10^-6、1.0×10^-7，使用ddH₂O代替模板，作為陰性對照，熒光定量體系為：SYBR PrimixEx Taq^TM10μL，正反向引物各0.8μL，cDNA模板2.0μL，Rox Reference Dye II 0.4μL，ddH₂O6.0μL，總體積20μL，反應程序：95℃變性10s，95℃ 5s，60℃ 25s，共40個循環；

S6：進行結果分析。

2.根據權利要求1所述的類風濕關節炎大鼠炎癥因子qRT-PCR檢測標準曲線的建立方法，其特征在于，S1中Wistar雌性大鼠體重為170±10g。

3.根據權利要求1所述的類風濕關節炎大鼠炎癥因子qRT-PCR檢測標準曲線的建立方法，其特征在于，S1中所有Wistar雌性大鼠日糧均為大小鼠商品飼料，自由采食、自由飲水，試驗時間為28d，所有試驗Wistar雌性大鼠在預飼7d后進入正式試驗期，正式試驗為期21d。

4.根據權利要求1所述的類風濕關節炎大鼠炎癥因子qRT-PCR檢測標準曲線的建立方法，其特征在于，S2中引物使用前用滅菌超純水溶解稀釋至100μmol/μL，-20℃保存備用。

5.根據權利要求1所述的類風濕關節炎大鼠炎癥因子qRT-PCR檢測標準曲線的建立方法，其特征在于，S3中正反向引物的濃度為10μmol·L^-1。

6.根據權利要求1所述的類風濕關節炎大鼠炎癥因子qRT-PCR檢測標準曲線的建立方法，其特征在于，S6包括以下步驟：

S6-1：CIA大鼠Cdk1、CD3D、RALB和RelA RT-PCR電泳結果

S6-2：藍白斑篩選及序列測定結果

S6-3：標準曲線的建立。