[發(fā)明專利]一種二妙散對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抑炎因子表達試驗方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811299140.8
• 申請日: 2018-10-22
• 公開（公告）號: CN109288911A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郝慧琴;李振;關(guān)建紅;王澤;高玉亭
• 申請（專利權(quán)）人: 山西中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: A61K36/756
• 分類號: A61K36/756;A61P19/02;A61P29/00;A61P37/04;G01N33/50
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1.一種二妙散對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抑炎因子表達試驗方法，其特征在于，試驗材料包括80只SD大鼠、生理鹽水、三種劑量的二妙散水煎劑、甲氨蝶呤，試驗方法包括如下步驟：

S1：試驗動物的處理

選擇80只SD大鼠，將所有CIA模型大鼠隨機分為6組，每組12-15只；灌胃生理鹽水，為正常對照組和模型對照組，灌胃三種劑量的二妙散水煎劑，灌胃甲氨蝶呤2.7mg/(kg·周)，為陽性對照組，每次灌胃1mL/100g，連續(xù)灌胃15天，禁食，麻醉，殺檢，腹主動脈取血，同時將脾臟、關(guān)節(jié)取材備用；

S2：建立CIA大鼠模型；

S3：脾臟系數(shù)指標(biāo)檢測

按照編號將大鼠體重與脾臟稱重記錄，通過計算公式脾臟系數(shù)＝脾臟重/體重得出結(jié)果，應(yīng)用SPSS 20.0軟件分析結(jié)果；

S4：血清中IL-6和TNF-α水平檢測

檢測血流變、血細胞檢測及血漿中腫瘤壞死因子、白介素6水平的變化，依照試劑盒操作程序進行檢測；

S5：關(guān)節(jié)滑膜切片病理檢測觀察

大鼠關(guān)節(jié)取材，EDTA脫鈣，脫鈣完成后縱向剖開踝關(guān)節(jié)，石蠟包埋，切片，HE染色，觀測各組炎癥的變化；

S6：吞噬細胞中IL-6、IL-37、TNF-α、CHRNA7 mRNA的表達檢測水平檢測；

提取大鼠成纖維樣滑膜細胞總RNA，測定總RNA濃度，在PCR儀中反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，在RT-PCR儀中與α7nAChR引物進行擴增，得到CT值，以GAPDH作參照，二妙散含藥組成分組與空白組之間進行比較，得到2^-ΔΔCT即為關(guān)節(jié)滑膜腔中α7nAChR的mRNA變化；

S7：數(shù)據(jù)分析

通過SPSS 20.0軟件分析，數(shù)據(jù)以均值xs表示，組間比較采用ANOVA分析和LSD-t檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二妙散對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抑炎因子表達試驗方法，其特征在于，步驟S1中的SD大鼠的體重為180±15g。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二妙散對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抑炎因子表達試驗方法，其特征在于，步驟S1中二妙散水煎劑由黃柏與蒼術(shù)1∶1制備。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二妙散對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抑炎因子表達試驗方法，其特征在于，步驟S1中二妙散水煎劑0.12g/kg、0.24g/kg、0.36g/kg為小中大劑量組。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種二妙散對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抑炎因子表達試驗方法，其特征在于，步驟S2包括如下步驟：

S2-1：初次免疫

通過牛二型膠原與弗氏完全佐劑乳化后濃度為1mg/mL，注射SD大鼠背部三點、尾跟部及任意一后足掌注射共0.5mL，正常組注射等量的生理鹽水；

S2-2：加強免疫

2周后，給予實驗組腹腔皮內(nèi)注射含有牛二膠原1mg/mL的免疫復(fù)合物乳化液0.2mL/鼠，方法同上正常組皮內(nèi)注射等量生理鹽水；

S2-3：成模檢驗

根據(jù)傳統(tǒng)關(guān)節(jié)評分指標(biāo)對實驗SD大鼠進行篩選。