[發明專利]一種人多能干細胞定向肺類器官分化流程

在審

• 申請號: 201811295348.2
• 申請日: 2018-11-01
• 公開（公告）號: CN109576211A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 董永聘;馮榮
• 申請（專利權）人: 上海淮泊生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 上海海貝律師事務所 31301
• 代理人: 范海燕

本發明公開了一種人多能干細胞定向肺類器官分化流程；具體流程包括：1)人多能干細胞培養于基質膠包被的培養板；2)ESC/iPSC生長至月95％匯合度的時候開始誘導分化；3)分化的第二階段為腹部前腸內胚層階段；4)分化的第三個階段為肺系分化階段；5)41天的誘導；本發明提供的人多能干細胞定向肺類器官分化流程，本誘導分化流程為目前最經濟，僅用5種細胞因子/小分子化合物的3D肺類器官定向分化平臺。

技術領域

本發明涉及一種人多能干細胞定向肺類器官分化流程。

背景技術

多能干細胞，是能夠分化成多種類型體細胞的干細胞，包括胚胎干細胞和誘導多能干細胞。這個多能的意思，顧名思義：有多種分化能力。多能干細胞的概念是相對于單能干細胞和全能干細胞而言的。人類多能干細胞憑借其無限自我更新，非常適合擴增；具有的多向分化潛能，可作為體細胞損傷、缺失的替代者，是理想的再生醫學種子細胞。自體多能干細胞來源的組織細胞可避免組織器官移植的排異現象，使得組織器官的自體再造和移植成為可能。肺損傷甚至肺功能衰竭是臨床常見的致命性疾病，目前物理人造肺尚不能使得肺衰竭患者有質量地生存；肺移植治療也存在移植肺來源有限、移植排異等諸多問題。所以，以多能干細胞為原料的組織工程肺是肺損傷患者理想的治療材料。然而，許多研究者多年來一直沒有理想的定向肺類器官分化的方案。

發明內容

本發明為解決上述技術問題而采用的技術方案是提供一種人多能干細胞定向肺類器官分化流程，其中，具體技術方案為：

具體流程包括：

1)人多能干細胞培養于基質膠包被的培養板，培養基為多能干細胞專用培養基；

2)ESC/iPSC生長至月95％匯合度的時候開始誘導分化，分化第一個階段為定型內胚層階段，誘導培養基為RPMI1640基礎培養基含100ng/ml的活化素A，每天跟換誘導培養基，DE階段持續3天，ESC/iPSC進入DE階段，應表達DE階段特異性標志物SOX17和FOXA2，同時下調多能性標志物OCT4；

3)分化的第二階段為腹部前腸內胚層階段，誘導培養基為Advanced-DMEM/F12基礎培養基含200ng/ml Noggin,500ng/ml FGF4,10μM SB431542和2μM CHIR99021，每天跟換誘導培養基，AFE階段持續4天；

4)分化的第三個階段為肺系分化階段，誘導培養基為含1％FBSAdvanced-DMEM/F12培養基，細胞經過DE和AFE階段共7天的誘導后，PBS洗2次，酶,消化3分鐘,1％FBSAdvanced-DMEM/F12培養基中和，1000轉離心，棄去上清，細胞包埋于預冷的基質膠中,37℃，5％CO2培養箱中靜置30分鐘，待基質膠固化后加入含1％FBS Advanced-DMEM/F12培養基，每3天跟換培養基，6-8天傳代一次，誘導35天；

5)經過41天的誘導，形成3D立體結構的肺類器官，表達多種肺系標志物，同時電鏡應能看到“9+2”微管結構，即肺近端纖毛細胞特異結構。

上述的人多能干細胞定向肺類器官分化流程，其中：1)中，基質膠包括膠原或Matrigel,BD；354277，培養基包括mTeSR1，StemCell Technologies；05850。

上述的人多能干細胞定向肺類器官分化流程，其中：2)中，誘導培養基包括Activin A,R&D systems；338-AC-50。

上述的人多能干細胞定向肺類器官分化流程，其中：3)中，基礎培養基含R&Dsystems；6057-NG-100，500ng/ml FGF4包括Peprotech；100-31-1MG,10μM SB431542包括Tocris；1614-10MG；2μM CHIR99021包括Tocris；4423-10MG。