[發明專利]一種人多能干細胞定向肺類器官分化流程

在審

• 申請號: 201811295348.2
• 申請日: 2018-11-01
• 公開（公告）號: CN109576211A
• 公開（公告）日: 2019-04-05
• 發明（設計）人: 董永聘;馮榮
• 申請（專利權）人: 上海淮泊生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 上海海貝律師事務所 31301
• 代理人: 范海燕

1.一種人多能干細胞定向肺類器官分化流程，其特征在于：

具體流程包括：

1)人多能干細胞培養于基質膠包被的培養板，培養基為多能干細胞專用培養基；

2)ESC/iPSC生長至月95％匯合度的時候開始誘導分化，分化第一個階段為定型內胚層階段，誘導培養基為RPMI1640基礎培養基含100ng/ml的活化素A，每天跟換誘導培養基，DE階段持續3天，ESC/iPSC進入DE階段，應表達DE階段特異性標志物SOX17和FOXA2，同時下調多能性標志物OCT4；

3)分化的第二階段為腹部前腸內胚層階段，誘導培養基為Advanced-DMEM/F12基礎培養基含200ng/ml Noggin,500ng/ml FGF4,10μM SB431542和2μM CHIR99021，每天跟換誘導培養基，AFE階段持續4天；

4)分化的第三個階段為肺系分化階段，誘導培養基為含1％FBS Advanced-DMEM/F12培養基，細胞經過DE和AFE階段共7天的誘導后，PBS洗2次，酶,消化3分鐘,1％FBS Advanced-DMEM/F12培養基中和，1000轉離心，棄去上清，細胞包埋于預冷的基質膠中,37℃，5％CO2培養箱中靜置30分鐘，待基質膠固化后加入含1％FBS Advanced-DMEM/F12培養基，每3天跟換培養基，6-8天傳代一次，誘導35天；

5)經過41天的誘導，形成3D立體結構的肺類器官，表達多種肺系標志物，同時電鏡應能看到“9+2”微管結構，即肺近端纖毛細胞特異結構。

2.如權利要求1所述的人多能干細胞定向肺類器官分化流程，其特征在于：1)中，基質膠包括膠原或Matrigel,BD；354277，培養基包括mTeSR1，StemCell Technologies；05850。

3.如權利要求2所述的人多能干細胞定向肺類器官分化流程，其特征在于：2)中，誘導培養基包括Activin A,R&D systems；338-AC-50。

4.如權利要求3所述的人多能干細胞定向肺類器官分化流程，其特征在于：3)中，基礎培養基含R&D systems；6057-NG-100，500ng/ml FGF4包括Peprotech；100-31-1MG,10μMSB431542包括Tocris；1614-10MG；2μM CHIR99021包括Tocris；4423-10MG。

5.如權利要求4所述的人多能干細胞定向肺類器官分化流程，其特征在于：4)中，細胞包埋于預冷的基質膠包括Matrigel,BD；356237。

6.如權利要求5所述的人多能干細胞定向肺類器官分化流程，其特征在于：5)中，表達多種肺系標志物包括NKX2.1肺系早期祖細胞的標志，SOX2肺近端祖細胞的標志，SOX9肺遠端祖細胞的標志，SPC及SPB肺遠端AT2細胞的標志，PDPN肺遠端AT1細胞的標志，P63肺近端基質細胞，basal cell的標志,CC10肺近端克拉克細胞，Club cell的標志,MUC5AC肺近端高腳杯細胞，Goblet cell的標志。