[發明專利]群體感應抑制劑篩選方法和應用

在審

• 申請號: 201811294609.9
• 申請日: 2018-11-01
• 公開（公告）號: CN109306369A
• 公開（公告）日: 2019-02-05
• 發明（設計）人: 岳美娥;藺巧燕
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34
• 代理公司: 青島中天匯智知識產權代理有限公司 37241
• 代理人: 郝團代

本發明涉及一種群體感應抑制劑的篩選方法和應用，該方法系電泳中介微分析技術，在毛細管中用酶催化水解底物的一步反應，然后在紫外210nm處直接測定產物峰面積實現酶活的測定和酶抑制劑的篩選方法；該方法不僅具有快速簡便、試劑消耗少、易于自動化、準確性高的優點，而且適用于群體感應抑制劑的篩選和分析，尤其適用于如中藥粗提液等混合化合物樣品中群體感應抑制劑的篩選，為以干擾群體感應系統作為新靶點的食品防腐保鮮策略提供理論依據。

技術領域

本發明屬于酶抑制劑篩選方法，特別涉及的是群體感應抑制劑的篩選方法和應用，可以用于中藥粗提物和合成小分子化合物的高通量篩選等方面。

背景技術

食品腐敗是一個復雜的過程，其中微生物作用是引起食品腐敗變質的主要因素之一。微生物通過分解蛋白質、脂質及糖類等營養物質進行生長繁殖，進而導致食品腐敗，從而導致巨大的經濟損失和嚴重的公共衛生問題（Gram L., Ravn L., Rasch M. J. FoodMicrobio., 2002, 78: 79-97）。群體感應(quorum sensing，QS)是細菌根據自身細菌濃度變化進行自我協調的一種群體行為，即細菌在生長繁殖過程中通過合成、分泌自誘導物作為信號分子，檢測細菌濃度；當自誘導物濃度隨著細菌群體密度達到一定閾值時，細菌便開啟細胞密度依賴的特定基因表達機制（Bassler B.L., Greenberg E.P., Stevens A.M.J. bacteriology, 1997, 179: 4043-4045）。現有研究表明QS通過調控與食品腐敗相關的蛋白質、脂肪、果膠、殼多糖等分解酶的活性導致食品腐敗，研究人員已在不同的腐敗食品中檢測出了不同類型的QS信號分子（張彩麗，朱素琴，汪映，孫秀嬌，曾名湧。生物技術通報，2014，150-155）。基于此，近年來信號分子介導的QS現象如何影響食品的品質以及與食品腐敗的關系成為食品防腐保鮮領域的一個新的研究熱點。但與QS在醫療、制藥和生物防御等方面取得的顯著進展相比，其在食品科學研究領域中仍然處于起步階段。

任何能夠阻止QS信號分子集聚或受體識別信號分子的過程都可阻斷細菌QS依賴的毒力基因表達。因此，基于QS抑制劑的QS感應系統干擾的研究對于新型防腐技術的研究與開發具有重要意義。目前，常用的QS抑制劑篩選方法有指示菌株法、生物傳感器法、計算機輔助設計法和動物模型法[21]。指示菌株法和生物傳感器法的篩選結果假陽性較高，動物模型法需要較為繁瑣的實驗步驟和較高的成本，而計算機輔助設計法屬于虛擬篩選，結果需要進一步驗證。電泳中介微分析（EMMA）是在流動注射分析（FIA）和毛細管電泳（CE）基礎上誕生的一項新的分析技術，被廣泛應用于天然產物中酶激動劑、抑制劑的篩選研究。Hamdan等(I. I. Hamdan, F. U. Afifi. Saudi Pharmaceutical Journal, 2010, 18:91-95.)建立的天然植物提取物中α-淀粉酶抑制劑的EMMA篩選方法，首次從Geraniumrobertianum和Aesculus hippocastanii中發現了α-淀粉酶抑制劑。Nehmé課題組(R. Nehmé, H. Nehmé, G. Roux, et al. Journal of Chromatography A, 2013, 1318: 257-264.)以激酶CDK5為靶點，建立天然產物黃酮及其衍生產物的CE抗腫瘤活性篩選方法。趙書林課題組先后建立了天然產物中α-葡萄糖苷酶(A. Z. Zhang, F. G. Ye, J. Y. Lu, S.L. Zhao. Food Chemistry, 2013, 141: 1854-1859.)、腺苷脫氨酶(X. W. Ji, F. G.Ye, P. T. Lin, S. L. Zhao. Talanta, 2010, 82: 1170-1174.)、單胺氧化酶(K. Hu,L. C. Zhang, X. T. Li, S. L. Zhao. Journal of Chromatography B, 2010, 878:3156-3160.)抑制劑的CE篩選方法，利用CE超強的的分離能力，對天然產物的粗提物進行篩選。最近，康經武課題組(T. D. Wang, Q. Q. Zhang, Y. M. Zhang, J. W. Kang.Journal of Chromatography A, 2014, 1337: 188-193.)報道了天然產物中蛋白激酶抑制劑的CE篩選方法。從文獻報道來看，目前，尚無采用毛細管電泳技術進行群體感應酶活性測定和抑制劑篩選的報道。因此，建立群體感應抑制劑毛細管電泳篩選方法，將為明確群體感應在食品腐敗中的機制，構建以干擾群體感應系統作為新靶點的食品防腐保鮮策略提供理論依據。