[發明專利]一種建立小鼠重型再生障礙性貧血模型的方法

在審

• 申請號: 201811294209.8
• 申請日: 2018-11-01
• 公開（公告）號: CN109157542A
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發明（設計）人: 林贈華;劉紅;劉海燕
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: A61K35/15
• 分類號: A61K35/15;A61D1/00;A61D3/00;A61D7/00
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 梁金娟

1.一種建立小鼠重型再生障礙性貧血模型的方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）、制備B6D2F1雌性小鼠，并選取同周齡的B6雌性小鼠作為淋巴結單個核細胞供鼠；（2）、對步驟（1）制備的B6D2F1雌性小鼠全身輻照；（3）、使用步驟（1）選取的B6雌性小鼠制備淋巴結單個核細胞懸液；（4）、向步驟（2）輻射后的B6D2F1雌性小鼠腹腔內注射供鼠的淋巴結單個核細胞；（5）、將注射單個核細胞的B6D2F1雌性小鼠放回原處飼養，注射當天為第0天，等待11-13天，模型制備完成。

2.根據權利要求1所述的一種建立小鼠重型再生障礙性貧血模型的方法，其特征在于，所述步驟（1）中制備F1雌性小鼠的過程，具體包括以下步驟：選取B6雌性小鼠與DBA/2雄性小鼠配種，繁育后的子一代雌性B6D2F1小鼠，選取8-12周齡B6D2F1雌性小鼠作為實驗用小鼠。

3.根據權利要求1所述的一種建立小鼠重型再生障礙性貧血模型的方法，其特征在于，所述步驟（2）中對B6D2F1雌性小鼠全身輻照的過程，具體包括以下步驟：將步驟（1）所制備的10-12只B6DF1雌性小鼠分別放入小鼠固定裝置中，各小鼠之間相互分隔；將裝有B6D2F1雌性小鼠的小鼠固定裝置放置在VARIAN直線加速器設備中，并按照標準操作流程對B6DF1雌性小鼠進行全身輻照，輻射過程的具體參數如下：照射野為40×40cm²；劑量為0°角2.5Gy，18°角2.5Gy；輻照能量為 6MV X線；輻照方法為等中心照射。

4.根據權利要求1所述的一種建立小鼠重型再生障礙性貧血模型的方法，其特征在于，所述步驟（3）中制備B6雌性小鼠的淋巴結單個核細胞懸液的過程，具體包括以下步驟：用頸椎脫臼法處死步驟（1）所選取的作為供鼠的B6雌性小鼠，酒精噴灑后，無菌條件下在超凈臺中解剖B6雌性小鼠，采集兩側頸部、腋下及腹股溝處的淋巴結，置于含有2ml RPMI1640培養基的無菌試管中，冰上保存；在進行步驟（4）中對B6D2F1雌性小鼠開始腹腔注射淋巴結細胞前的1-2小時，將采集的B6雌性小鼠淋巴結轉移至無菌的小型組織研磨器中研磨，予90μM尼龍濾網過濾后轉移到15ml的無菌試管中，加入10ml RPMI1640洗滌，4°C低溫離心，1500rpm×5min，棄上清，用2ml IMDM重懸單個核細胞，取10μl進行分別稀釋50倍和100倍后在光鏡下觀察計數，取均值計算細胞濃度，調整細胞濃度為1.9×10⁷-2.1×10⁷/ml，放置冰上備用。

5.根據權利要求1所述的一種建立小鼠重型再生障礙性貧血模型的方法，其特征在于，所述步驟（4）中輻射后的B6D2F1雌性小鼠腹腔內注射供鼠的淋巴結單個核細胞的過程，具體包括以下步驟：在B6D2F1雌性小鼠全身照射后 4-6小時，用1ml無菌注射器抽取步驟（3）中所制備的 B6雌性小鼠淋巴結單個核細胞懸液0.4ml，其中細胞的個數為7.6×10⁶-8.4×10⁶個細胞；左手抓取B6D2F1雌性小鼠，使其腹部朝上頭部略向下垂；抓緊背部皮膚使使腹部皮膚緊繃，于兩大腿根連線與腹中線交叉點一側1厘米位置將裝有B6雌性小鼠淋巴結單個核細胞懸液的注射器的針尖刺入B6D2F1雌性小鼠的皮下，在皮下平行腹中線推進針頭3-5mm，再以45°角向腹腔內刺入；針尖通過腹肌后，抵抗力消失，回抽無回流物，緩慢推入B6雌性小鼠淋巴結單個核細胞懸液。

6.根據權利要求1所述的一種建立小鼠重型再生障礙性貧血模型，其特征在于，所述步驟（5）后還包括步驟（6）、重型再生障礙性貧血模型小鼠的驗證。

7.根據權利要求6所述的一種建立小鼠重型再生障礙性貧血模型的方法，其特征在于，所述步驟（6）中重型再生障礙性貧血模型小鼠的驗證過程，具體包括以下步驟：

S1、建立B6D2F1模型組小鼠和TBI對照組小鼠：在第12天時，分別取出注射有供鼠的淋巴結單個核細胞的B6D2F1雌性小鼠作為B6D2F1模型組小鼠，取出經全身輻照且未注射供鼠淋巴結細胞的B6D2F1雌性小鼠作為TBI對照組；

S2、從內眥靜脈用一次性毛細吸管分別采集B6D2F1模型組小鼠和TBI對照組小鼠的小鼠眼眶靜脈血，采集0.5ml至含有2ul EDTA的2ml凍存管中，邊采集邊混勻；其中，EDTA預先離心至凍存管底部；

S3、頸椎脫臼法處死小鼠，無菌條件下解剖采集取得每只小鼠的右側股骨于含2mlRPMI-1640的無菌試管中；采集的右側股骨標本均于冰上保存；將右側股骨與肌肉軟組織分離，分別切除右側股骨的兩端，用1ml注射器抽取RPMI1640快速沖出骨髓內有核細胞，反復沖洗直至髓腔完全變白為止，予90μM尼龍濾網過濾后轉移到15ml的無菌試管中，加入10mlRPMI1640洗滌，4°C低溫離心，1500rpm×5min，棄上清，1ml ACK紅細胞裂解液冰上裂解5分鐘，期間在震蕩器上震蕩1次，加入10ml RPMI1640洗滌2次，離心速度1500rpm，×5min，用1ml RPMI1640重懸單個核細胞并通過70μM Falcon 細胞濾網過濾收集每只小鼠骨髓單個核細胞，并制備成股骨骨髓單個核細胞的懸濁液，以上所有操作均在冰上進行；

S4、無菌條件下分離小鼠的左側股骨，放入Bouin固定液中60min后，將左側股骨的標本在不同濃度乙醇中進行脫水，再將左側股骨的標本放入含2ml Hemapun865甲液的聚乙烯模具中浸泡2h，將乙液1ml滴入模具，靜置20min；將包埋好的活檢組織切至厚度為4μm的切片，放在載玻片上置于甲醇3min后，在Jenner工作液內染6min，再放置Giemsa工作液1h，用蒸餾水沖洗后，分別在醋酸水、95%乙醇中浸漬5~6次，乙醇快速脫水，二甲苯透明后晾干，再用中性樹膠封固，最后通過光學顯微鏡進行觀察；其中，Bouin固定液采用飽和苦味酸75ml、40%甲醇20ml、冰醋酸5ml配制而成；所述乙液設置為聚乙二醇10ml與N,N二甲基苯甲胺2ml的混合液；其中，甲液采用甲基丙烯酸-2-羥基乙基酯單體100ml、聚乙二醇10ml、過氧化苯甲酰0.4g制備而成；

S5、將步驟S2的采集B6D2F1模型組小鼠和TBI對照組小鼠并置于凍存管中的靜脈血置于血液混勻器上，按標準操作流程將外周血標本逐個測定分析每只小鼠的血常規結果；取10μl步驟S3中制備的股骨骨髓單個核細胞懸液分別稀釋50倍和100倍后在光鏡下通過計數板計數，取均值計算每只小鼠每支股骨骨髓的單個核細胞計數；將塑料包埋的左側股骨切片放于光學顯微鏡下觀察并進行拍照分析造血細胞比例。