[發明專利]一種建立小鼠重型再生障礙性貧血模型的方法

在審

• 申請號: 201811294209.8
• 申請日: 2018-11-01
• 公開（公告）號: CN109157542A
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發明（設計）人: 林贈華;劉紅;劉海燕
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: A61K35/15
• 分類號: A61K35/15;A61D1/00;A61D3/00;A61D7/00
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 梁金娟

本發明提供一種建立小鼠重型再生障礙性貧血模型的方法，包括以下步驟：（1）、制備B6D2F1雌性小鼠，并選取同周齡的B6雌性小鼠作為淋巴結單個核細胞供鼠；（2）、B6D2F1雌性小鼠全身輻照；（3）、制備B6雌性小鼠淋巴結單個核細胞懸液；（4）、向輻射后的B6D2F1雌性小鼠腹腔內注射供鼠的淋巴結單個核細胞；（5）、將注射單個核細胞的B6D2F1雌性小鼠放回原處飼養，注射當天為第0天，等待11?13天，模型制備完成。本發明采用國內大部分大型醫療機構配備有直線加速器的輻照設備，節省了另外購買設備所產生的費用；供鼠的淋巴結單個核細胞誘導再生障礙性貧血小鼠時所需細胞數量少，通過腹腔注射方法成功率高，制備時間較短，可擴大該再生障礙性貧血模型的應用。

技術領域

本發明屬于小鼠模型制備方法領域，具體涉及一種通過免疫機制介導來建立小鼠重型再生障礙性貧血模型的方法。

背景技術

目前國內外絕大多數的研究者使用小鼠來建立小鼠重型再生障礙性貧血模型進行再生障礙性貧血發病機制研究[Chen J. Animal Models for Acquired Bone MarrowFailure Syndromes. Clin Med Res 2005; 3: 102- 108.]。誘導再生障礙性貧血小鼠模型的方法主要有以下幾種：1.化學方法：由馬利蘭、苯、環磷酰胺、氯霉素等化學藥物或毒物誘導的AA模型[Molyneux G, Gibson FM, Whayman M et al. Serum FLT-3 ligand in abusulphan-induced model of chronic bone marrow hypoplasia in the female CD-1mouse. Int J Exp Pathol 2008; 89: 159-170. Turton JA, Sones WR, Andrews CM etal. Further development of a model of chronic bone marrow aplasia in thebusulphan-treated mouse. Int J Exp Pathol 2006; 87: 49- 63.]；2.物理和化學混合方法：如聯合使用馬利蘭、放射線等來聯合建立再生障礙性貧血小鼠模型[Meng A, WangY, Van Zant G et al. Ionizing radiation and busulfan induce prematuresenescence in murine bone marrow hematopoietic cells. Cancer Res 2003; 63:5414- 5419.] ；3.由免疫機制介導機制誘導的再生障礙性貧血小鼠模型：如病毒感染和外源性淋巴細胞輸入等誘導的再生障礙性貧血小鼠模型[Feng X, Lin Z, Sun W et al.Rapamycin is highly effective in murine models of immune-mediated bone marrowfailure. Haematologica 2017; 102: 1691- 1703. Tang Y, Desierto MJ, Chen J etal. The role of the Th1 transcription factor T-bet in a mouse model ofimmune-mediated bone-marrow failure. Blood 2010; 115: 541- 548. Bloom ML,Wolk AG, Simon-Stoos KL et al. A mouse model of lymphocyte infusion-inducedbone marrow failure. Exp Hematol 2004; 32: 1163- 1172.]。以上各種模型各有其優缺點，化學方法的缺點是造模時間周期長，容易造成骨髓永久性損傷；物理和化學混合的方法操作相對簡單，造模周期短，成功率高且死亡率低，但第25天左右模型小鼠的造血功能會自行恢復正常。隨著再生障礙性貧血免疫學發病機制的進一步明朗，研究人員發現用單純的物理或(和)化學因素誘導的模型不符合再生障礙性貧血的病理生理學發病過程，并不適合用于再生障礙性貧血發病機制的研究，且目前也很少有學者以此為模型用于研究[ChenJ. Animal Models for Acquired Bone Marrow Failure Syndromes. Clin Med Res2005; 3: 102- 108.]。我們應用干擾素γ腹腔注射聯合白消安灌胃的方法成功建立了穩定的BALB/c小重型再生障礙性貧血小鼠模型[寧方穎, 林贈華, 劉紅等. 干擾素-γ與白消安合用誘導建立小鼠重型再生障礙性貧血模型的研究. 中華血液學雜志 2011; 32:779- 784.]，并證實了該小鼠模型可能更接近并模擬了人類重型再生障礙性貧血的免疫學的發病特點[寧方穎, 林贈華, 劉紅等. 干擾素-γ與白消安合用誘導建立小鼠重型再生障礙性貧血模型的研究. 中華血液學雜志 2011; 32: 779- 784. 劉海燕, 林贈華, 劉紅等. 調節性T細胞和Th17細胞在新型小鼠重型再生障礙性貧血模型中的變化. 中華血液學雜志, 2012, 33: 653- 656.]。但該模型操作也相對繁瑣，死亡率＞20%，不適合用于需要大批量再障小鼠模型的試驗。美國Neal Young博士實驗室于2004年起使用異體淋巴細胞尾靜脈注射方法誘導再生障礙性貧血小鼠模型獲得成功，但模型死亡率極高且小鼠所需供者淋巴結數量較多[Bloom ML, Wolk AG, Simon-Stoos KL et al. A mouse model oflymphocyte infusion-induced bone marrow failure. Exp Hematol 2004; 32: 1163-1172.]。后續該研究團隊對造模方法進行了改進，使用全身輻照（TBI）加供者淋巴結細胞輸注方法建立再生障礙性貧血小鼠模型，目前國際比較公認的是使用該實驗室所建立的F1再生障礙性貧血小鼠模型和C.B10再生障礙性貧血小鼠模型[Chen J, Brandt JS, EllisonFM et al. Defective stromal cell function in a mouse model of infusion-induced bone marrow failure. Exp Hematol 2005; 33: 901- 908. Chen J, EllisonFM, Eckhaus MA et al. Minor antigen h60-mediated aplastic anemia isameliorated by immunosuppression and the infusion of regulatory T cells. JImmunol 2007; 178: 4159- 4168.]。兩種造模方法都是使用TBI+B6小鼠淋巴結單個核細胞方案誘導，造模后模型穩定，死亡率低，骨髓衰竭的特點和再障患者相似。F1模型是使用BALB/cBy母鼠和B6公鼠、或者B6母鼠和DBA/2公鼠配種后的子一代小鼠作為造模用小鼠(F1)，使用5Gy的γ射線TBI后從尾靜脈輸注B6小鼠的淋巴結單個核細胞建立再障小鼠模型，一般供者淋巴細胞在注射后3-7天起可以歸巢到模型小鼠骨髓，在7天起開始顯著擴增并導致模型小鼠出現骨髓衰竭[Chen J, Brandt JS, Ellison FM et al. Defectivestromal cell function in a mouse model of infusion-induced bone marrowfailure. Exp Hematol 2005; 33: 901- 908.]。該模型穩定且符合再障的臨床特點，但需要專門的γ射線的放射源，限制了其應用。國外也有學者使用BALB/c母鼠和C57BL/6 公鼠配種的子一代F1小鼠作為受鼠，在使用3 Gy的γ射線TBI 4-6小時后從腹腔輸注5×10⁷ B6小鼠的脾臟單個核細胞建立再生障礙性貧血小鼠模型[Therapeutic targeting of NOTCHsignaling ameliorates immune-mediated bone marrow failure of aplastic anemia.J Exp Med, 2013,210(7): 1311- 1329]。我國黃麗芳等人用BALB/c小鼠(受鼠)經5.0 Gy⁶⁰Coγ射線照射后,輸入5×10⁶個DBA/2小鼠(供鼠)的淋巴結細胞來建立免疫介導的骨髓衰竭動物模型。[免疫損傷介導的骨髓衰竭小鼠模型的建立. 中華血液學雜志, 2009,30(10): 683- 688.]，而尹利明等人則通過使用BALB/c小鼠(受鼠)經5.0 Gy ⁶⁰Coγ射線照射后，在輻照后4小時內通過小鼠尾靜脈輸入2×10⁶個DBA/2小鼠(供鼠)的淋巴結細胞來建立免疫介導的再生障礙性貧血小鼠模型[Effects of sodium copper chlorophyllin onmesenchymal stem cell function in aplastic anemia mice. Chin J Integr Med.2013, 19(5): 360- 366.]，而楊等人則用DBA/2小鼠(供鼠)的淋巴結細胞和胸腺細胞的混合物通過尾靜脈注入到5.0 Gy 的⁶⁰Coγ射線照射后的BALB/c小鼠(受鼠)來建立再生障礙性貧血小鼠模型[Effect of Danggui Buxue Tang on immune-mediated aplasticanemia bone marrow proliferation mice，2013, 19(5): 360- 366.]。