[發明專利]一種高效分離臍帶胎盤間充質干細胞的方法及應用

在審

• 申請號: 201811293316.9
• 申請日: 2018-11-01
• 公開（公告）號: CN109294979A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 中晶生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/073
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及干細胞領域。本發明初步建立一種臍帶、胎盤干細胞分離培養培養體系及應用。所述方法包括：（1）新生胎兒臍帶、胎盤的處理與運輸；（2）臍帶、胎盤沖洗、切割、消化處理；（3）原代細胞及組織快細致處理；（4）全新添加物、傳代換液處理。本發明可以在節約成本的基礎上更高效率分離培養臍帶、胎盤間充質干細胞。

技術領域

本發明涉及干細胞領域，尤其是分離培養人臍帶、胎盤間充質干細胞的方法，在培養中我們添加了胎盤組織液，最大程度上模擬了細胞原本生長環境，使得細胞起步更平穩、增殖更快。

背景技術

干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。根據干細胞的發育階段分為兩類:胚胎干細胞和成體干細胞。間充質干細胞（MSC），是一種具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞，這種干細胞能夠發育成骨、軟骨、脂肪和其他類型的細胞?？勺鳛槔硐氲姆N子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復，尤其對治療衰老和組織器官損傷修復有很大的臨床應用價值。最初MSC提取大多數來自骨髓，但隨著年齡的老化，骨髓中的干細胞數目也會顯著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓 MSC 移植給異體可能引起免疫反應，且提取干細胞過程對患者的損傷性大，直接影響了骨髓MSC的臨床應用，替代骨髓MSC的間充質干細胞來源迫在眉睫。

臍帶、胎盤是產婦生產后的“廢棄物”。臍帶包括一條靜脈和兩條動脈，周圍是Wharton’s Jelly，外層由羊膜來源的上皮包裹。胎盤起源于胚胎發育期胚外中胚層，由羊膜層、蛻膜層等組成。臍帶的Wharton’s Jelly、胎盤的羊膜層和蛻膜層中有著豐富的間充質干細胞，而且相對骨髓間充質干細胞具有更高的增殖能力，更低的免疫原性以及更高的分化潛能，而且采集過程簡單，無任何危害損傷及倫理學困擾。以上原因使臍帶、胎盤間充質干細胞更適合臨床的應用。但是，臍帶、胎盤組織分離干細胞的方法和技術還不是完全成熟，傳統的方法不僅對臍帶、胎盤來源細胞傷害大，回收效率低，雜細胞多，細胞增殖速率慢，而且污染風險大，本發明恰恰從來源上保證安全無污染，而且提供了一個簡單和高效的臍帶、胎盤組織分離、培養、凍存間充質干細胞的方法，足以滿足醫藥、科研、臨床等領域的需求。

發明內容

本發明的目的是解決現有獲取臍帶、胎盤間充質干細胞方法的缺陷，提供一種實用簡單的從臍帶、胎盤中大量分離間充質干細胞的方法。本發明采用方法回收率和純度，增殖能力比傳統方法都有顯著提高，而且無污染確保在臨床中的安全應用。

1.來源上，我們選取經過嚴格身體篩查的產婦及胎兒的臍帶、胎盤，確保健康，確保沒有遺傳病、確保沒有感染性疾病及病原體攜帶，確保無污染，并且會留有產婦及胎兒信息留檔以便查證；

2.臍帶、胎盤取出后經由專業有資質的人員處理，用含有青鏈霉素和咪康唑的生理鹽水將臍帶、胎盤表面的血漬初步清洗干凈，避免紅細胞裂解，造成細胞內物質污染臍帶、胎盤組織，將臍帶、胎盤放入保存液中，低溫冷鏈2-8℃全程監控快速運輸到實驗室，即到即處理（72h內）；

3.臍帶、胎盤組織進入實驗室必須遵守嚴格制度，登記相應表格，交由專業人員快速用含有青鏈霉素和咪康唑的PBS溶液沖洗胎盤組織，洗去殘留的保存液和血漬，選取質量較好部分，用經過121℃，103.4kPa滅菌的手術器械，剝離組織塊；

4.將組織塊進一步切割成1-3mm³大小浸潤在PBS溶液中，組織消化液37℃，搖床處理10-30min，室溫靜置20-40min，2-8℃靜置冷消化12-24h；

5.根據方法4，組織消化液包含胰蛋白酶、膠原酶Ⅱ、Ⅳ、分散酶、EDTA、脂肪酶中的一種或多種酶，0.25%胰酶、0.05-0.2%的EDTA、 0.1-1%膠原酶Ⅱ、Ⅳ、0.1mg/mL分散酶、0.1-0.2%脂肪酶，相對單一酶消化效率顯著提高；

6.根據方法4，37℃，搖床處理10-30min，室溫靜置20-40min，2-8℃靜置冷消化12-24h，方法多元，更加適合大量樣本處理；