[發(fā)明專利]一種高效分離臍帶胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的方法及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811293316.9
• 申請(qǐng)日: 2018-11-01
• 公開（公告）號(hào): CN109294979A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中晶生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/074
• 分類號(hào): C12N5/074;C12N5/073
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.本發(fā)明建立一種高效分離培養(yǎng)臍帶、胎盤干細(xì)胞的方法：A.取材安全；B.冷鏈運(yùn)輸，全程監(jiān)控，安全運(yùn)輸；C.進(jìn)一步處理組織，挑選好的部位；D.組織消化液分散細(xì)胞；E.篩網(wǎng)過濾細(xì)胞，密度梯度離心進(jìn)一步提純細(xì)胞，保留組織塊；F.用添加胎盤組織液的MSC培養(yǎng)基，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；G.傳代或凍存細(xì)胞；H.質(zhì)量安全、生物學(xué)效力檢測，保障培養(yǎng)安全、細(xì)胞純度及增殖分化能力。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其步驟A，所用臍帶、胎盤可以是人自然分娩或剖腹產(chǎn)后廢棄的胎盤；產(chǎn)婦必須經(jīng)過健康體檢，無遺傳病、感染性疾病或攜帶者，以及其他疾病，嚴(yán)格無菌操作；臍帶、胎盤必須新鮮（0-2小時(shí)內(nèi)）。

3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其步驟B,將臍帶、胎盤表面的血漬初步清洗干凈，清洗液可以是含有青鏈霉素和咪康唑的生理鹽水；臍帶、胎盤全程冷鏈運(yùn)輸，全程監(jiān)控，安全運(yùn)輸指將胎盤放入臍帶、胎盤保存液中，低溫冷鏈全程監(jiān)控快速運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，即到即處理（0-72小時(shí)），提高安全等級(jí)，做到安全效率。

4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其步驟C，用含有青鏈霉素和咪康唑的PBS溶液沖洗臍帶、胎盤組織，洗去殘留的保存液和血漬，最后一次用純凈的PBS沖洗，選取質(zhì)量較好部分，剝離組織塊，這樣保證我們培養(yǎng)的細(xì)胞更加安全、活力高。

5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其步驟D,將組織塊進(jìn)一步切割成1-3mm3大小浸潤在新的PBS溶液中，不含抗生素和胎牛血清，避免造成殘留，組織消化液37℃搖床，b.室溫靜置；c.2-8℃靜置冷消化，多元化消化處理，樣本再多，一樣可以保證效率。

6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，組織消化液指以下一種或幾種成分：胰蛋白酶、膠原酶Ⅱ、Ⅳ、分散酶、EDTA，比單一酶消化效率高。

7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，各種酶的濃度可以是：胰蛋白酶0.05-0.25%，膠原酶Ⅱ0.05-0.3%，膠原酶Ⅳ0.05-0.3%，分散酶0.1-2.4u/ml，EDTA0.005-0.1%。

8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其步驟E，消化液經(jīng)篩網(wǎng)過濾，PBS沖洗，去除雜細(xì)胞，挑選單細(xì)胞，進(jìn)一步提純可以用羥乙基淀粉離心法也可以用Ficoll離心法；未完全消化的組織塊不研磨，用PBS重懸，一起離心，避免研磨對(duì)細(xì)胞造成更大的損傷。

9. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其步驟F，用添加胎盤組織液的無血清培養(yǎng)基；胎盤組織液含有多種因子，正是胎盤細(xì)胞原始的生長環(huán)境，將細(xì)胞和組織塊分瓶，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，縮短培養(yǎng)時(shí)間。

10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，待細(xì)胞瓶組形成克隆后，胰酶消化，以一定密度重鋪或作傳代處理，組織塊瓶組克隆消化處理，剩余組織塊半量換液重貼，既不浪費(fèi)培養(yǎng)基也利于細(xì)胞增殖。

11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其步驟G，克隆增多，選擇傳代或凍存處理，每一次操作完成都對(duì)樣本進(jìn)行安全監(jiān)測。

12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其步驟H，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行生物安全、生物學(xué)效力及表型檢測，并做數(shù)據(jù)歸檔，從源頭到結(jié)束全部保證安全、有條理。