[發明專利]一種硬脂酰載體蛋白脫氫酶基因（SAD）的CAPS標記方法

在審

• 申請號: 201811289979.3
• 申請日: 2018-10-31
• 公開（公告）號: CN109338000A
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發明（設計）人: 李飛;金黎平;雷尊國;卞春松;徐建飛;段紹光;羅小波;尹旺
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所;貴州省生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 商小川

本發明公開了一種硬脂酰載體蛋白脫氫酶基因（SAD）的CAPS標記方法，它包括如下步驟：一、基因組DNA提取；二、對SAD基因DNA序列的查找、序列分析及引物設計；三、PCR反應和產物回收及純化；四、PCR產物測序；五、CAPS的標記：將兩個種測序所得的SAD基因序列通過BLASTN進行比對，分析SNP位點，基于找到的SNP位點，利用軟件分析是否可以轉化為CAPS的標記，然后對目標片段進行PCR擴增，選擇相應的限制性內切酶進行酶切反應，用瓊脂糖凝膠進行產物檢測，即可利用軟件SPSS對親本、F1和BC1群體的CAPS標記類型與冷馴化能力進行相關分析，旨在為分子標記輔助選擇冷馴化能力較強的基因型提供有利的幫助，取得了很好的效果。

技術領域

本發明涉及一種硬脂酰載體蛋白脫氫酶基因（SAD），尤其涉及一種硬脂酰載體蛋白脫氫酶基因（SAD）的CAPS標記方法，屬于基因技術領域。

背景技術

低溫凍害主要與植物的雙層膜脂相關，研究報道很多不同種類的植物在低溫條件下，細胞質膜中多元脂肪酸不飽和度的增加與耐冷或耐凍性的增加相關聯。而Δ9硬脂酰載體蛋白脫氫酶對于原生質膜從凝膠狀轉變為液晶相是最關鍵的，這個酶在硬脂酰載體蛋白（18:0-ACP）的碳9和碳10之間引入第一個雙鍵使之產生油酰載體蛋白（18:1 Δ9-ACP）。隨后的不飽和鍵的引入與第一個雙鍵引入作用相比逐漸變小。在所有的植物細胞中都發現有可溶性的Δ9-硬脂酰基載體蛋白脫氫酶（SAD），SAD催化硬脂酰載體蛋白變為油酰基載體蛋白并對決定植物中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比率起重要作用。這個比率與植物的很多功能密切相關，特別在植物的低溫馴化方面。從很多植物上克隆了SAD基因，并進行結構和功能分析，包括黃瓜、蓖麻子、紅花、菠菜、蕓苔、荷荷巴油和馬鈴薯等，表明在冷馴化期間SAD基因轉錄增加與馬鈴薯冷馴化響應相關聯。目前，還沒有關于SAD基因的CAPS標記方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提供一種硬脂酰載體蛋白脫氫酶基因（SAD）的CAPS標記方法，以耐凍野生馬鈴薯Solanum commersonii和霜凍敏感的S.cardiophyllum為試材，開發了SAD基因的CAPS標記方法，并用這兩個種的回交一代進行了驗證，旨在為分子標記輔助選擇馬鈴薯冷馴化能力較強的基因型提供有利的幫助。

本發明的技術方案為：一種硬脂酰載體蛋白脫氫酶基因（SAD）的CAPS標記方法，它包括如下步驟：

一、基因組DNA提取；

二、對SAD基因DNA序列的查找、序列分析及引物設計：從NCBI網站下載到硬脂酰載體蛋白脫氫酶基因（SAD）的mRNA序列（X78935.2），在茄科基因組資源網站上利用BLASTsequence Alignments工具進行SAD基因的mRNA序列比對，找到高度相似的SAD基因的DNA序列，然后通過Primer primer軟件設計SAD基因的引物，用DNAMAN進行序列比對；

三、PCR 反應和產物回收及純化：用步驟一得到的引物進行PCR擴增；

四、PCR產物測序：在測序之前要再進行一次PCR反應；