[發明專利]一種硬脂酰載體蛋白脫氫酶基因（SAD）的CAPS標記方法

在審

• 申請號: 201811289979.3
• 申請日: 2018-10-31
• 公開（公告）號: CN109338000A
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發明（設計）人: 李飛;金黎平;雷尊國;卞春松;徐建飛;段紹光;羅小波;尹旺
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蔬菜花卉研究所;貴州省生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 商小川

1.一種硬脂酰載體蛋白脫氫酶基因（SAD）的CAPS標記方法，其特征在于：它包括如下步驟：

一、基因組DNA提取；

二、對SAD基因DNA序列的查找、序列分析及引物設計：從NCBI網站下載到硬脂酰載體蛋白脫氫酶基因（SAD）的mRNA序列（X78935.2），在茄科基因組資源網站上利用BLASTsequence Alignments工具進行SAD基因的mRNA序列比對，找到高度相似的SAD基因的DNA序列，然后通過Primer primer軟件設計SAD基因的引物，用DNAMAN進行序列比對；

三、PCR 反應和產物回收及純化：用步驟一得到的引物進行PCR擴增；

四、PCR產物測序：在測序之前要再進行一次PCR反應；

五、CAPS的標記：將兩個種測序所得的SAD基因序列通過用BLASTN進行比對，分析SNP位點，基于找到的SNP位點，利用軟件dCAPS Finder 分析是否可以轉化為CAPS的標記，然后對目標片段進行PCR擴增，選擇相應的限制性內切酶進行酶切反應，用瓊脂糖凝膠進行產物檢測，即可利用統計分析軟件SPSS的Pearson雙側檢驗對親本、F1和BC1群體的CAPS標記類型與冷馴化能力進行相關分析。

2.根據權利要求1所述的硬脂酰載體蛋白脫氫酶基因（SAD）的CAPS標記方，其特征在于：所述步驟一中包括如下分步驟：

A：在1.5mL離心管中裝入2張待測葉片；

B：用液氮研磨成粉末，加入65℃預熱的2% CTAB（添加β巰基乙醇，終濃度為1%）700μL；

C：65℃水浴1h，每隔10min左右搖動一次；

D：取出冷卻至室溫，然后加入預冷的24:1的氯仿-異戊醇溶液700μL，輕輕搖勻5min；

E：14000rpm離心10min，吸取上清液約500μL至1.5mL離心管中，加入等體積預冷的異丙醇，輕輕上下顛倒混勻；

F：-20℃沉淀30min至DNA抱團沉淀，14000rpm離心10min；

G：倒掉上清液，加入1mL70%乙醇洗滌沉淀，上下顛倒6-8次，7500rpm離心5min，倒掉上清液，加入1mL90%乙醇洗滌沉淀，7500rpm離心5min，倒掉上清液；

H：在通風櫥放至DNA晶體干透無酒精味道，加入100μL含有RNA酶 ( RNas濃度為0.1mg/ml)的無菌水復溶，37℃溫浴2h除去RNA；

I：取2μL DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3.根據權利要求1所述的硬脂酰載體蛋白脫氫酶基因（SAD）的CAPS標記方，其特征在于：所述步驟三中的反應體系包括：11.2μL去離子水，4μL 5×PCR緩沖液，0.8μL 5mMdNTPs，0.8μL 5μM正向引物，0.8μL 5uM反向引物，0.4μL Taq DNA 連接酶，2μL 30ng/μLDNA模板，總體積20μL；循環條件是：94℃ 4min，94℃ 20s， 45℃30s， 58℃ 2min，共35個循環；接著是72℃ 7min，用2%的瓊脂糖凝膠進行產物檢測。

4.根據權利要求1所述的硬脂酰載體蛋白脫氫酶基因（SAD）的CAPS標記方，其特征在于：所述步驟四中的反應體系為：1.75μL去離子水，0.75μL 2.5X PCR緩沖液，1μL 5μM引物（正向或者反向），0.50μL Big dye, 1μL 純化后的DNA；循環條件是：95℃ 3min；95℃ 20s，50℃20s， 60℃ 4min 共50個循環；接著是72℃ 5min，PCR產物進行清洗，然后進行測序。

5.根據權利要求1所述的硬脂酰載體蛋白脫氫酶基因（SAD）的CAPS標記方，其特征在于：所述步驟五中的PCR產物酶切體系為：2μL 的NEBbuffer4、5μL PCR產物、1μL EcorⅠ、12μL ddH2O，再進行酶切，酶切條件：37℃，3h。