[發明專利]一種GST-like標簽蛋白在大腸桿菌表達體系中的應用

在審

• 申請號: 201811288350.7
• 申請日: 2019-01-18
• 公開（公告）號: CN109797163A
• 公開（公告）日: 2019-05-24
• 發明（設計）人: 王峰
• 申請（專利權）人: 無錫佰翱得生物科學有限公司
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/70;C12P21/02
• 代理公司: 東莞市科安知識產權代理事務所(普通合伙) 44284
• 代理人: 王勇剛

本發明涉及一種新的GST?like親和標簽蛋白(Δ4)的研究方法與應用，屬于生物技術領域。昆蟲內源性蛋白GST?like標簽蛋白在大腸桿菌表達體系中的應用，該GST?like標簽蛋白的序列如SEQUENCE No.1所示。該GST?like標簽蛋白與L?Glutathione(Reduced)(GSH)結合能力強，能作為標簽蛋白，替代GST標簽蛋白。

技術領域

本發明涉及GST標簽蛋白技術領域，具體地，涉及一種GST-like標簽蛋白在大腸桿菌表達體系中的應用，以及其表達方法和利用該GST-like標簽蛋白純化目的蛋白的方法。

背景技術

GST(谷胱甘肽巰基轉移酶)標簽蛋白相對分子量較大，約26KD，插入在目的蛋白的C末端或N末端，大腸桿菌中常用在N端。GST標簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶。GST標簽蛋白能夠增強蛋白可溶性，可以在不同的宿主中表達，適用范圍廣，但是僅能純化可溶性蛋白，由于GST標簽分子量較大，可能會影響蛋白質的功能和下游實驗。

發明內容

本申請發明人在純化帶有GST標簽蛋白時發現了一個天然的能夠穩定表達的昆蟲內源性蛋白GST-like標簽蛋白，且該GST-like標簽蛋白與L-Glutathione (Reduced)(GSH)結合能力強，故對該天然GST-like標簽蛋白進行純化分析，并研究能否作為標簽蛋白，以替代GST標簽蛋白。

本申請發明人通過實驗檢測并比較了GST標簽蛋白和GST-like標簽蛋白(Δ 4)與L-Glutathione(Reduced)(GSH)的結合強弱以及重組蛋白的表達水平，實驗發現GST-like親和標簽蛋白(Δ4)與蛋白的親和速度更快，親和力更強，在實際應用中，能夠代替GST標簽，進行蛋白純化。

本申請提供了昆蟲內源性蛋白GST-like標簽蛋白在大腸桿菌表達體系中的應用，該GST-like標簽蛋白的序列如SEQUENCE No.1所示，具體如下：MPIDLYYVPGSAPCRAVLLTAKALNLNLNLKLVDLHHGEHLKPEYIKLNPQHTVPTLVDDGFSIWESR AIITYLVNKYGKGSSLYPEEPKARALVDQRLYFDIGTLYQRFADYFYPQVFGGAPADKDKLAKIEDAL QLLNTFLEGQKFCAGPTLTLADLSLVASVSSFEASDVDFKKYPNKRWYETVKSSAPGYLEANEKGLDA FKGLVNSMMKK。

上述的GST-like標簽蛋白在大腸桿菌中的表達方法，將表達GST-like標簽蛋白的核苷酸序列導入大腸桿菌表達載體中構建重組質粒,使GST-like標簽蛋白插入在目的蛋白的N末端與其融合；構建成功的重組質粒進行轉化、擴大培養，異丙基硫代-Β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導表達。

所述大腸桿菌表達載體為pET28a-N-His-TEV。

用所述的GST-like標簽蛋白純化大腸桿菌表達目的蛋白的方法，包括如下步驟：

(1)將表達GST-like標簽蛋白的核苷酸序列導入大腸桿菌表達載體中構建重組質粒,使GST-like標簽蛋白插入在目的蛋白的N末端與其融合；構建成功的重組質粒進行轉化、擴大培養，異丙基硫代-Β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導表達GST-like標簽蛋白與目的蛋白的融合蛋白；

(2)收集過夜培養的菌液，超聲破碎菌體，收集可溶部分，應用GSTrap FF 柱子對可溶部分進行純化，用濃度為5mM-25mM的GSH進行洗脫，得到純化融合蛋白。