[發明專利]高毒力株幽門螺桿菌的環介導等溫擴增檢測方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201811287718.8
• 申請日: 2018-10-31
• 公開（公告）號: CN109182569A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 汪運山;曹翠明;楊煒華;裴鳳艷
• 申請（專利權）人: 濟南市中心醫院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 鄭平

本發明提供一種高毒力株幽門螺桿菌的環介導等溫擴增檢測方法和試劑盒。其中，特別針對幽門螺桿菌CagA基因的核酸序列，設計5條LAMP檢測引物，包括外引物F3、B3；內引物FIP、BIP，環引物LB，保證了LAMP擴增的高度特異性。該技術對高毒力株幽門螺桿菌的檢測特異性強，具有快速、高效、儀器要求簡易、操作簡便，成本低，易于在基層推廣使用的特點。同時，本發明首次設計、篩選到高毒力株幽門螺桿菌LAMP檢測引物，并建立了高毒力株幽門螺桿菌LAMP檢測方法，填補了國內外在此檢測領域的空白。

技術領域

本發明屬于醫學分子生物學診斷技術領域，具體涉及一種高毒力株幽門螺桿菌的環介導等溫擴增檢測方法和試劑盒。

背景技術

該部分內容僅提供與本發明有關的背景信息，并不必然構成現有技術。

幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，HP)是一種微需氧，顯微鏡下呈螺旋形的革蘭氏陰性桿菌。是目前所知能夠在人體胃液中生存的唯一微生物種類。流行病學調查顯示，世界范圍內HP在普通人群的感染率高達50％以上，發展中國家甚至達到70％～90％。感染的分布也存在差異，經濟越落后、文化水平越低感染率越高。

幽門螺旋桿菌感染可表現為胃炎、消化道潰瘍、淋巴增生性胃淋巴瘤等。HP胃部感染的不良預后是胃癌，早在1994年國際癌癥研究中心就將其列為I類致癌物。長期以來HP感染及機制一直是世界關注及研究的熱點之一。但是，流行病學調查顯示，并非所有感染HP者均導致胃部疾病，感染者只有10％發展為有明顯癥狀的消化性潰瘍或者胃炎，最終發展成胃癌的僅占1％左右。究竟是什么關鍵因素最終導致HP感染后的不同結局呢？研究表明，人體感染HP除了遺傳易感性及環境易感性之外，還與其具有獨特的毒力因子有關，例如尿素酶、鞭毛蛋白、粘附因子、細胞毒素相關蛋白(CagA)和空泡細胞毒素(VacA)等。已經公認，由CagA基因編碼的CagA蛋白是最重要的毒力因子之一，CagA蛋白可以通過誘導更多的酪氨酸磷酸化和白介素-8的分泌，也可以通過調節一些信號通道系統，刺激腫瘤細胞增殖和提高腫瘤細胞侵襲作用而促進胃癌的發生。HP菌株可以根據有無CagA基因將其分為兩種類型，一種是高毒力HP株，有CagA基因，表達CagA蛋白，具有毒素活性，可導致胃部炎癥或者胃癌；另一種為低毒力HP株，無CagA基因，不表達CagA蛋白，不具備毒素活性，不會引起胃炎等疾病的發生。因此，CagA基因被認為高毒力HP菌株最重要的標志物，如果能夠通過某種方法，只檢測CagA基因，從而把攜帶有CagA蛋白的高毒力HP株的人群篩選出來，利用三聯或者四聯藥物加以根治，就可以大大減少由HP感染造成的胃癌的發病率。

臨床上檢測HP的方法有許多種，例如血清學實驗、呼氣實驗、分離培養法、尿素酶法、分子生物學(如PCR)法等。各有利弊，如血清法檢測抗體，不適合現癥感染；呼氣試驗容易受抗生素、鉍制劑等敏感藥物干擾導致假陽性，而且放射性元素會對人體有一定危害，尤其不適用于孕婦和小兒；分離培養法是目前公認的診斷Hp感染的“金標準”，但培養條件要求苛刻，敏感性低且耗時費力；胃幽門螺旋桿菌快速尿素酶法屬于侵入性有創檢查，患者痛苦較大，且適用于用藥前的首次胃鏡檢查，不適合復檢。以上幾種方法均側重于HP的普查，并不能區分高毒力菌株和低毒力菌株，有文獻報道可以通過PCR檢測毒力基因CagA或者尿素基因(Ure A)來診斷高毒力HP感染，PCR方法靈敏高效，但費用高昂，不適合在基層醫院推廣普及。

環介導基因恒溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification ofnucleic acid,LAMP)是一種新型恒溫基因擴增技術，其通常是針對靶基因的六個獨立區域設計兩對特殊內、外引物，同時利用Bst脫氧核苷酸聚合酶啟動循環鏈置換反應，完成核酸擴增。該技術具有快速、簡便、敏感性和特異性高、檢測范圍廣等優點。近年來，該技術已逐步應用于病原微生物的檢測，但目前尚未見該方法應用于高毒力幽門螺旋桿菌的檢測，更無合適高效的引物用于該領域的LAMP檢測。

發明內容