[發(fā)明專利]一種人鼠嵌合單克隆抗體生物類似藥的純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811287090.1
• 申請日: 2018-10-31
• 公開（公告）號: CN109320611B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭子榮;彭彼得;劉瑩;曾建成
• 申請（專利權(quán)）人: 鼎康（武漢）生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K1/18
• 代理公司: 上海弼興律師事務(wù)所 31283
• 代理人: 薛琦;余化鵬

本發(fā)明公開了一種人鼠嵌合單克隆抗體生物類似藥的純化方法，包括將含有人鼠嵌合單克隆抗體生物類似藥上樣至強(qiáng)陽離子層析柱進(jìn)行純化，其中所述純化在上樣后包括平衡、淋洗、再平衡和洗脫等步驟。本發(fā)明洗脫操作步驟簡單，對層析儀器分辨率和精確度的要求較低，節(jié)省了純化時間，在保證純度、提高回收率的同時，也節(jié)約了生產(chǎn)成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體涉及一種人鼠嵌合單克隆抗體生物類似藥的純化方法。

背景技術(shù)

抗體(antibody)是在對抗原刺激的免疫應(yīng)答中，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類糖蛋白，它是能與相應(yīng)抗原特異的結(jié)合、產(chǎn)生各種免疫效應(yīng)(生理效應(yīng))的球蛋白。單克隆抗體(monoclonal antibody，簡稱單抗)是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體。單克隆抗體藥物，即單一的抗原刺激作用于單一B淋巴細(xì)胞可以分泌出單一的抗體。單克隆抗體藥物是生物醫(yī)藥領(lǐng)域中最耀眼的明珠。該類藥物具有靶向性強(qiáng)、特異性高和毒副作用低等特點，代表了藥品治療領(lǐng)域的最新發(fā)展方向，并且在抗腫瘤和自身免疫系統(tǒng)缺陷治療領(lǐng)域得到了有力的推廣。單抗藥物的大規(guī)模生產(chǎn)對技術(shù)和工藝的要求極高。體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和蛋白純化技術(shù)是單抗藥物生產(chǎn)工藝的難點和技術(shù)壁壘。

目前抗CD20單克隆抗體是治療B淋巴瘤的最有效的靶向性生物治療藥物，在治療NHL中有極其重要的地位。其常見的純化方法有陽離子層析、陰離子層析、蛋白A層析等。生物類似藥對純化工藝在酸、堿和主峰之間比例上要求較高。需要通過層析技術(shù)將酸、堿峰比例控制在原研藥的批次間變化范圍內(nèi)，從而滿足法規(guī)中對相似度的要求。按照各國法規(guī)對生物類似藥開發(fā)的要求，生物類似藥的電荷異構(gòu)體要與原研藥保持一致，也就是生物類似藥的酸，堿和主峰的比例要控制在原研藥的批次變化范圍內(nèi)。為了達(dá)到此要求，一方面可以通過上游細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對產(chǎn)品的電荷異構(gòu)體進(jìn)行調(diào)節(jié)，但另一方面純化技術(shù)也在生物類似藥的電荷異構(gòu)體調(diào)控上起關(guān)鍵作用。目前主要的手段是使用陽離子交換層析技術(shù)來對電荷異構(gòu)體進(jìn)行調(diào)節(jié)。

然而因為電荷異構(gòu)體本身的性能差別不大，通過純化手段來調(diào)節(jié)電荷異構(gòu)體有相當(dāng)難度。在現(xiàn)有的技術(shù)上，通過陽離子層析來調(diào)節(jié)電荷異構(gòu)體通常需要對層析的產(chǎn)品進(jìn)行分段收集，然后進(jìn)行電荷異構(gòu)體的檢查，然后來進(jìn)行混合得到所需要的產(chǎn)品。該模式具有工藝復(fù)雜，耗時長，回收率低等特點。如果在現(xiàn)有的層析方法上直接收集產(chǎn)品，則損失的產(chǎn)品更多，回收率更低。

單克隆抗體生物類似藥例如抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體類似藥的要求較高，根據(jù)原研藥的電荷異構(gòu)體數(shù)據(jù)，將標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為酸峰比例應(yīng)小于20％、主峰大于65％且堿峰應(yīng)小于10％，較為符合單克隆抗體類似藥的應(yīng)用要求。鑒于在陽離子層析步驟中純化方法工藝復(fù)雜，耗費時間多，回收率比較低。因此，非常有必要開發(fā)一種操作簡單，節(jié)約時間，回收率較高的陽離子層析方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的問題是克服人鼠嵌合單克隆抗體生物類似藥現(xiàn)有純化工藝復(fù)雜、耗時較長和回收率較低等技術(shù)缺陷。針對上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了人鼠嵌合單克隆抗體生物類似藥的純化方法，既簡化了工藝流程，節(jié)省了時間和緩沖液的用量，又提高了目標(biāo)產(chǎn)物回收率。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案之一為：一種人鼠嵌合單克隆抗體生物類似藥的純化方法，包括將含有人鼠嵌合單克隆抗體生物類似藥上樣至強(qiáng)陽離子層析柱進(jìn)行純化，其中所述純化在上樣后還包括以下步驟：

(1)平衡步驟，在所述層析柱中加入2-5個柱體積的平衡緩沖液，所述平衡緩沖液含55～65mM的鈉鹽溶液；

(2)淋洗步驟，在所述層析柱中加入2-6個柱體積的淋洗緩沖液，所述淋洗緩沖液含110～120mM的鈉鹽溶液；

(3)再平衡步驟，在所述層析柱中加入0.5-2個柱體積的平衡緩沖液；和

(4)洗脫步驟，在所述層析柱中加入5-8個柱體積的洗脫緩沖液，所述洗脫緩沖液含135～150mM的鈉鹽溶液；

其中，所述平衡緩沖液、淋洗緩沖液和洗脫緩沖液的pH值為5.4-5.6。