[發(fā)明專利]一種基于SSR標(biāo)記法的甜瓜雜交種子純度的鑒定方法

在審

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• 申請日: 2018-10-31
• 公開（公告）號: CN109337999A
• 公開（公告）日: 2019-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 裴卓強;沈啟海;寧濤;盧星邑
• 申請（專利權(quán)）人: 寧夏泰金種業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686
• 代理公司: 北京弘權(quán)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11363
• 代理人: 逯長明;許偉群

本申請實施例示出了一種基于SSR標(biāo)記法的甜瓜雜交種子純度的鑒定方法，方法包括：以母本材料的基因組DNA和父本材料的基因組DNA為模板，采用公布的SSR分子標(biāo)記進行PCR擴增，篩選出上游引物和下游引物，以雜交甜瓜單株的基因組DNA為模板，加入上游引物和下游引物，進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物，統(tǒng)計擴增產(chǎn)物的帶型結(jié)果，根據(jù)帶型結(jié)果計算甜瓜雜交種子的純度；本申請實施例的鑒定方法通過分別提取母本材料的基因組DNA和父本材料的基因組DNA，得到能同時產(chǎn)生母本特異性標(biāo)記和父本特異性標(biāo)記的引物，使用該引物檢測雜交甜瓜的純度進而鑒定甜瓜雜交種子的純度，與傳統(tǒng)方法相比，本申請實施例的鑒定方法省時省力而且穩(wěn)定性好，能夠準(zhǔn)確的鑒定雜交種的純度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于SSR標(biāo)記法的甜瓜雜交種子純度的鑒定方法。

背景技術(shù)

種子是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，種子質(zhì)量優(yōu)劣直接影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效果。種子純度是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，建立可靠、便捷的種子純度檢測方式，對于準(zhǔn)確快速評價種子質(zhì)量，保證種子生產(chǎn)者、銷售者和使用者的利益具有重要意義。甜瓜是我國重要的特色水果，色、香、味俱全，深受消費者喜愛。目前，甜瓜雜交種在我國占據(jù)相當(dāng)市場，然而，甜瓜品種的配制依賴于傳統(tǒng)的去雄授粉技術(shù)，因此，種子純度問題嚴(yán)重制約甜瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展，因此，鑒定甜瓜雜交種純度十分必要。傳統(tǒng)種子純度鑒定主要通過種子形態(tài)鑒定、田間表型鑒定等，費工，費時，而且準(zhǔn)確性難以保證。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明實施例提供一種基于SSR標(biāo)記法的甜瓜雜交種子純度的鑒定方法，解決傳統(tǒng)種子純度鑒定主要通過種子形態(tài)鑒定、田間表型鑒定等，費工，費時，而且準(zhǔn)確性難以保證的問題。

本申請實施例示出了一種基于SSR標(biāo)記法的甜瓜雜交種子純度的鑒定方法，所述方法包括以下步驟：

分別提取甜瓜葉片母本材料的基因組DNA和甜瓜葉片父本材料的基因組DNA；

以所述甜瓜葉片母本材料的基因組DNA和所述甜瓜葉片父本材料的基因組DNA為模板，采用公布的SSR分子標(biāo)記進行PCR擴增，篩選出上游引物和下游引物；

以雜交甜瓜單株的基因組DNA為模板，加入所述上游引物和所述下游引物，進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；

將所述擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，得到凝膠擴增產(chǎn)物；

將所述凝膠擴增產(chǎn)物進行EB染色后，得到染色擴增產(chǎn)物；

將所述染色擴增產(chǎn)物置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)成像，統(tǒng)計帶型結(jié)果；

根據(jù)所述帶型結(jié)果計算所述甜瓜雜交種子的純度。

進一步地，采用改良熱堿法分別提取所述甜瓜葉片母本材料的基因組DNA和所述甜瓜葉片父本材料的基因組DNA，所述改良熱堿法包括：

將所述甜瓜葉片剪碎置于離心管中，向離心管中加入NaOH，將離心管在沸水中放置預(yù)定時間，向離心管中加HCl中和，將離心管放置于Tris-HCl進行沸水浴，得到所述甜瓜葉片母本材料的基因組DNA和所述甜瓜葉片父本材料的基因組DNA。

進一步地，所述上游引物的核苷酸序列為：5'-AATCACTGCTTCCAAATGGG-3'，所述下游引物的核苷酸序列為：5'-GATCGGATTTCTTTGTCGGA-3'。

進一步地，所述PCR擴增為多態(tài)性擴增。

進一步地，所述進行PCR擴增時，PCR反應(yīng)體系包括：10μL的2×taq mix，0.4μL的所述上游引物，0.4μL的所述下游引物，2μL的所述甜瓜葉片母本材料的基因組DNA和所述甜瓜葉片父本材料的基因組DNA混合物，加水至20μL；

PCR反應(yīng)過程包括，單次反應(yīng)過程94℃溫度條件下反應(yīng)5min后降溫，94℃溫度條件下反應(yīng)30s后降至60℃條件下反應(yīng)30s后，升溫至72℃條件下反應(yīng)15s；