[發明專利]柑橘衰退病毒微滴數字PCR定量檢測試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201811285052.2
• 申請日: 2018-10-31
• 公開（公告）號: CN109321680A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 周彥;王瑛麗;楊真;王琴;劉瑩潔
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院柑桔研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙) 50211
• 代理人: 鄒曉艷

本發明公開了一種柑橘衰退病毒微滴數字PCR定量檢測試劑盒，包括總RNA提取試劑，引物CTV7、CTV6F和CTV6R，T7體外轉錄試劑盒，QX200 ddPCR EvaGreen supermix試劑盒。還公開了一種柑橘衰退病毒微滴數字PCR定量檢測方法，包括如下步驟：(1)抽提總RNA；(2)用CTV7和CTV6R擴增總RNA，轉錄合成cRNA，用CTV6R對cRNA進行逆轉錄反應，獲得cDNA；(3)以cDNA為模板，用CTV6F和CTV6R進行微滴數字ddPCR檢測。本發明的ddPCR方法靈敏度高、特異性強，靈敏度比(RT?)qPCR檢測靈敏度高100倍。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種柑橘衰退病毒微滴數字PCR定量檢測試劑盒及方法。

背景技術

柑桔是世界第一大水果，柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的柑橘衰退病是世界柑桔生產中最嚴重的病害之一。CTV是屬長線形病毒屬(Closteroviridae)的正義單鏈RNA病毒，是目前已知病毒中基因組最大的病毒。CTV主要通過嫁接和蚜蟲傳播，發病迅速。30年代以來，柑橘衰退病已經造成了1億株樹的死亡。巴西作為世界柑桔產量第一的國家，曾一度因為柑桔衰退病的為害而使柑桔產業瀕臨崩潰。迄今為止，柑橘衰退病仍是世界柑桔產業的嚴重威脅。

準確、靈敏、快速的檢測方法是柑橘病害防治、預測預報和建立無病毒苗木繁殖體系的前提和保障。目前，柑橘衰退病的檢測方法主要有指示植物鑒定法、電子顯微鏡技術、血清學鑒定、(RT-)PCR、實時熒光定量(RT-)PCR[(RT-)qPCR]檢測體系以及(RT-)LAMP。但指示植物鑒定法費時費力，顯癥率低。電子顯微鏡技術，血清學鑒定靈敏度較低。PCR產物易產生交叉污染且只能定性檢測，qPCR需要依賴Cq值和標準曲線才能對起始模板進行相對定量分析。但由于不同樣品之間的擴增效率是不同的，導致Cq值不是恒定不變的，同時qPCR在目的序列含量低、表達量差異十分微小、反應體系中含大量背景序列或抑制物等情況下，靈敏度和精確度都受到很大限制。因此微滴數字PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)應運而生。

ddPCR克服了qPCR技術的一些不足，能夠把不同DNA模板分隔在不同的油包水小水滴中，有效避免反應過程中不同引物間、產物間的相互雜交和不同產物之間的競爭抑制，因此能夠得到較好的擴增效率，也可實現不同模板的同時擴增，從而大大提高了檢測的靈敏度和精確度。因此ddPCR是一種采用終點法判讀、能夠實現復雜來源樣品中極低含量核酸分子穩定檢出的無需標準曲線，也不需要內參的絕對定量技術。目前，ddPCR在醫學臨床診斷上的應用逐漸興起，但在植物學研究、植物病害檢驗檢疫方面的報道很少。

發明內容

本發明的目的是提供一種特異性好、靈敏度高的可以準確定量檢測柑橘衰退病毒的微滴數字PCR檢測試劑盒及方法。

本發明實現其目的采用的技術方案是：

一種柑橘衰退病毒微滴數字PCR定量檢測試劑盒，包括總RNA提取試劑，引物CTV7、CTV6F和CTV6R，T7體外轉錄試劑盒，QX200 ddPCR EvaGreen supermix試劑盒，所述CTV7、CTV6F和CTV6R引物序列為：

CTV7：5′-TAATACGACTCACTATAGGGTCCGACTCTGATAACGATG-3′，

CTV6F：5′-TCCGACTCTGATAACGATG-3′，

CTV6R：5′-ACCGCTAAACGATACAAC-3′。

一種柑橘衰退病毒微滴數字PCR定量檢測方法，利用前述的檢測試劑盒進行，包括如下步驟：

(1)取待測植株的葉片，抽提總RNA；