[發明專利]柑橘衰退病毒微滴數字PCR定量檢測試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201811285052.2
• 申請日: 2018-10-31
• 公開（公告）號: CN109321680A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 周彥;王瑛麗;楊真;王琴;劉瑩潔
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院柑桔研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙) 50211
• 代理人: 鄒曉艷

1.一種柑橘衰退病毒微滴數字PCR定量檢測試劑盒，其特征在于：包括總RNA提取試劑，引物CTV7、CTV6F和CTV6R，T7體外轉錄試劑盒，QX200 ddPCR EvaGreen supermix試劑盒，所述CTV7、CTV6F和CTV6R引物序列為：

CTV7：5′-TAATACGACTCACTATAGGGTCCGACTCTGATAACGATG-3′，

CTV6F：5′-TCCGACTCTGATAACGATG-3′，

CTV6R：5′-ACCGCTAAACGATACAAC-3′。

2.一種柑橘衰退病毒微滴數字PCR定量檢測方法，其特征在于：利用權利要求1所述的檢測試劑盒進行，包括如下步驟：

(1)取待測植株的葉片，抽提總RNA；

(2)以提取的總RNA為模板，用引物CTV7和CTV6R擴增總RNA，擴增產物純化后，用T7體外轉錄試劑盒轉錄合成cRNA，利用特異性引物CTV6R對cRNA進行逆轉錄反應，獲得cDNA；

(3)以步驟(2)制得的cDNA為模板，利用特異性引物CTV6F和CTV6R進行微滴數字ddPCR檢測。

3.如權利要求2所述的柑橘衰退病毒微滴數字PCR定量檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中微滴數字ddPCR檢測的擴增條件為:95℃5min；95℃30s，56℃30s，40個循環；4℃5min；90℃5min；4℃90min；每秒降低2℃。

4.如權利要求2或3所述的柑橘衰退病毒微滴數字PCR定量檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中ddPCR反應體系總共為20μL：2μL模板cDNA、濃度均為200nmol·L^-1的引物CTV6F、CTV6R各0.4μL、10μL 2×QX200 ddPCR EvaGreen supermix、余量為ddH₂O。