[發明專利]一種CRISPR單堿基修復系統及其應用

在審

• 申請號: 201811284549.2
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109517845A
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發明（設計）人: 胡爭;周燦權;樊惟文;麥慶云
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/85;C12N15/10;A61K48/00;A61P7/06
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文;羅堯

本發明公開了一種CRISPR單堿基修復系統，包括能表達sgRNA和Cas9的真核表達載體，以及作為供體模板的單鏈寡核苷酸，其中，所述單鏈寡核苷酸的堿基序列與以需要修復的單堿基兩側第30～60個堿基之間的堿基序列基本一致，區別在于，在所述供體模板上，與需要修復的單堿基相應的堿基為未突變野生型的堿基，以及需要修復的單堿基的一側發生了無義突變。本發明還公開了CRISPR單堿基修復系統在制備治療β珠蛋白基因CD17A→T點突變導致的β地中海貧血病的藥物中的應用。本發明中將CRISPR/Cas表達質粒和donor二者共同轉染到細胞中，在293TT細胞中特異性的誘導β17地中海貧血中基因突變位點的無痕定向改造，對開展基于單基因點突變疾病的基因編輯精準治療，具有重要的臨床應用價值。

技術領域

本發明涉及基因編輯技術領域，尤其是一種CRISPR單堿基修復系統及其 在治療單基因點突變導致的β17地中海貧血遺傳疾病中的應用。

背景技術

β地中海貧血病(β地貧)是由于β珠蛋白基因的突變或缺失導致的構成血 紅蛋白HbA(a2β2)的珠蛋白肽鏈合成減少或不能合成，造成a與β肽鏈合成 失衡所引起的一種常染色體隱性遺傳病。β地貧基因常以點突變最為常見，β珠 蛋白基因的CD17(A→T)點突變是最早報道的與β地貧疾病相關的點突變之 一。

目前可通過終生輸血治療地中海貧血癥，然而絕大多數患兒在積極治療的情 況下仍在成年前死亡。另一種治療方法則是通過骨髓或造血干細胞移植，但要找 到相匹配的異體捐贈者非常困難，且費用不菲。目前只能通過胚胎植入前行遺傳 學診斷技術或通過胎兒臍血細胞基因檢測技術，篩選正常的胚胎或胎兒來阻斷地 貧致病基因的傳播。隨著基因編輯技術的出現與發展，如何利用基因編輯技術對 基因突變類型遺傳性疾病進行預防與治療是目前新興的疾病臨床治療模式。

從2011年美國率先提出“邁向精準醫學”的倡議后，中國的精準醫學也不斷 向前推進。“精確的基因編輯”是基因編輯技術的核心，也是精準醫學的重要體現。 開展基于特異性基因突變所致疾病的基因編輯精準治療，獲得更加精準高效的 基因編輯是未來疾病治療的創新方向。CRISPR技術自2012年面世以來，極大 地促進了基因編輯在多種疾病包括惡性腫瘤和遺傳性疾病的治療作用，獲得了 廣泛的臨床應用，諸如此類：2016年美國國立衛生研究所批準了從癌癥患者體 內提取出免疫系統的T細胞，利用CRISPR對T細胞進行基因修飾，并將基因 修飾后的T細胞輸回病人體內，基因修飾后的T細胞將靶向摧毀腫瘤細胞；2018 年5月，NATURE雜志報道了通過CAR-T治療治愈一例患者白血病的病例；在 中國，2016年10月首次批準了利用CRISPR開展人體臨床試驗，來治療化療、 放療以及其它療法治療無效的轉移性非小細胞肺癌患者等等。已有報道利用 CRISPR治療地中海貧血：通過利用基因編輯工具CRISPR精確特異性修復患者 體細胞β珠蛋白基因(hemoglobin subunitbeta，HBB)缺陷基因，然后將基因 編輯與修復后的體細胞誘導成多能干細胞，最后移植入體內，從而分裂和分化 為相應有功能的紅細胞，來治療和緩解β-地中海貧血患者癥狀。目前，針對β 型地中海貧血的基因治療，著手對象已從誘導型多能干細胞(iPS)和造血干細胞(HSC)過渡到人類胚胎，直接阻斷該遺傳性疾病的垂直傳播。