[發明專利]一種分離PEG修飾蛋白樣品中游離PEG的高效液相色譜方法

在審

• 申請號: 201811283408.9
• 申請日: 2018-10-31
• 公開（公告）號: CN109030669A
• 公開（公告）日: 2018-12-18
• 發明（設計）人: 周曉盼;黃學英
• 申請（專利權）人: 蘇州賽分科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/54
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 常亮

本發明涉及分析技術領域，特別涉及一種分離PEG修飾蛋白樣品中游離PEG的高效液相色譜方法。該方法為將含有游離PEG的PEG修飾蛋白樣品采用高效液相色譜進行分離，色譜條件為：色譜柱規格為4.6mm內徑×150mm長度，5μm粒徑，孔徑；流動相A相為0.1％三氟乙酸水溶液，B相為0.1％三氟乙酸乙腈溶液；柱溫為10～80℃；流速為0.2～1.2mL/min；樣品進樣量為8～12μL。本發明采用高效液相色譜分析法聯合蒸發光散射檢測器，以含三氟乙酸的水和乙腈溶液為流動相，通過控制柱溫、流速及檢測器條件，調整梯度，能很好的分離PEG修飾蛋白中的游離PEG。

技術領域

本發明涉及分析技術領域，特別涉及一種分離PEG修飾蛋白樣品中游離PEG的高效液相色譜方法。

背景技術

蛋白質化學修飾的目的是用于生物醫學和生物技術方面。在生物醫學方面，化學修飾可以降低免疫原性的免疫反應性、抑制免疫球蛋白E的產生等；在生物技術領域，酶經過化學修飾后能夠在有機溶劑中高效地發揮催化作用，并表現出新穎的催化性能。由于聚乙二醇(PEG)溶解性好，毒性低，無免疫原性，蛋白質經其修飾后不但保持了水溶性而且在有機溶劑中的溶解性也增加，因此PEG類修飾劑應用最多。另外PEG修飾后的蛋白藥物能提高穩定性和溶解性，延長蛋白藥物的半衰期，減少免疫反應，具有較高的臨床應用價值。

目前，公知的檢測PEG修飾蛋白中游離PEG的方法有SDS-PAGE碘染色法(雜志《化學通報》，2009年05期，聚乙二醇修飾蛋白體系的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法新探)、體積排阻液相色譜方法(雜志《藥學研究》，2013，Vol32，No.11，PEG-EPO中游離PEG的示差折光率檢測)、硅膠基質反相液相色譜方法(雜志《微生物學免疫學進展》，2007年第53卷第3期，PEG化重組人白細胞介素-6制品游離PEG測定方法的研究)等。SDS-PAGE碘染色法無法進行游離PEG的定量分析，同時顯色膠片很快就會褪色；體積排阻液相色譜及硅膠基質反相液相色譜(C18、C4)方法分離度很難滿足要求。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種分離PEG修飾蛋白樣品中游離PEG的高效液相色譜方法。該方法可有效分離PEG修飾蛋白樣品中游離PEG，并可定量分析。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種分離PEG修飾蛋白樣品中游離PEG的高效液相色譜方法，將含有游離PEG的PEG修飾蛋白樣品采用高效液相色譜進行分離，高效液相色譜的色譜條件為：

以聚苯乙烯二乙烯基苯(PS/DVB)為基質的色譜柱作為檢測用柱，色譜柱的規格為4.6mm內徑×150mm長度，5μm粒徑，孔徑；

流動相A相為0.1％三氟乙酸水溶液，B相為0.1％三氟乙酸乙腈溶液；

檢測器為蒸發光散射檢測器(ELSD)；

柱溫為10～80℃；

流速為0.2～1.2mL/min；

樣品進樣量為8～12μL。

作為優選，PEG修飾蛋白樣品為采用含10mg/mL組氨酸、100mM氯化鈉的20mM檸檬酸緩沖液稀釋后得到的待測溶液。

作為優選，待測溶液中PEG修飾蛋白樣品的濃度為5～15mg/mL。

優選地，待測溶液中PEG修飾蛋白樣品的濃度為10mg/mL。

作為優選，流動相A相為經過超聲脫氣、0.45μm水系濾膜過濾所得的水溶液。

作為優選，B相為經過超聲脫氣、0.45μm有機濾膜過濾所得的乙腈溶液。

作為優選，超聲脫氣的時間為半小時，之后冷卻至室溫。