[發明專利]一種外源表達BAK1蛋白的方法

有效

• 申請號: 201811280276.4
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109402174B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 湯嬌;孫亞東;韓志富;柴繼杰;石巍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蜜蜂研究所
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N9/12;C12Q1/48
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本發明提供了一種外源表達BAK1蛋白的方法。該方法包括步驟：將C端帶有6個His標簽的BAK1胞外結構域的外顯子基因用BamH1和Xho1酶切，采用BamH1和Xho1酶切pFastBac^TM1載體，前述酶切后的產物連接，構建得到外源表達BAK1蛋白的載體；載體轉染昆蟲細胞，培養該細胞后，收獲細胞和上清，上清液經層析，純化后獲得構象正確的BAK1蛋白，表達量達8.6mg/L。本發明方法克服了現有技術采用原核表達系統無法獲得正確構象的BAK1蛋白或采用其他真核表達系統BAK1蛋白無法表達的缺點，提高了構象正確的BAK1蛋白的表達量，節約了成本。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體地，涉及一種外源表達BAK1蛋白的方法。

背景技術

植物受體激酶根據胞外識別結構域的不同可以分為很多不同的受體蛋白家族，其中數量最多的研究最為深入的是富亮氨酸重復類受體激酶(leucine-rich repeatsreceptor kinase，LRR-RK)，LRR-RK家族分為16個亞家族。BAK1蛋白屬于II家族LRR-RK，615個氨基酸，在植物體內廣泛表達，結構組成包括N-端信號肽序列、5個LRR、一個絲氨酸/脯氨酸豐富區、單次跨膜結構域和絲/蘇氨酸激酶結構域。

BAK1蛋白是模式植物擬南芥中的受體蛋白激酶，位于細胞表面上，蛋白受體激酶的結構分為一個胞外識別結構域、單次跨膜區和胞內激酶結構域。胞外識別結構域負責識別外源的信號分子，進而激活該受體，引起胞內激酶結構域發生磷酸化，從而將信號由細胞外傳遞至細胞內，引起細胞內的一系列生化反應。BAK1蛋白是植物識別細菌鞭毛蛋白，植物生長發育調控，花器官脫落等很多生理過程中的共受體，該受體在植物體內的缺失會造成植物對細菌的免疫性下降，導致植物被細菌侵染，植株矮小，功能失調等，過表達BAK1蛋白會提高植物對細菌的耐受性，獲得抗病新植株。BAK1蛋白的缺失會導致植物發育不正常，甚至導致植株致死。細菌鞭毛蛋白與BAK1蛋白結合后會激活植物的免疫反應，幫助植物抵抗病菌的入侵，體外獲得BAK1蛋白，可以用于篩選新型的小分子藥物，篩選出可以激活植物免疫反應的小分子藥物，當細菌入侵時，植物可以抵抗細菌的侵害，研制新型抗細菌藥物，促進植物的抗病表型并提高植物的產量。

目前的研究內容主要集中在探究BAK1這類受體蛋白的胞外識別結構域是如何識別胞外的信號源識別后被激活的機制。主要手段是通過X射線衍射技術獲取蛋白的精細三維結構，在分子水平上闡述上述問題。由于BAK1蛋白只有一個疏水的跨膜區，這對于在體外重組該全長蛋白是一個很大的阻礙。由于蛋白的疏水跨膜區是將細胞膜上的蛋白牢牢錨定在細胞膜上的區域，跨膜區越多，蛋白在細胞膜上越穩定，若跨膜區較多的膜蛋白在體外重組過程中可以采用去垢劑等化學試劑來模擬細胞膜，進而成功獲得膜蛋白的體外成功表達，但是對于只有一個疏水跨膜區的蛋白，比如BAK1蛋白，帶有跨膜區的全長蛋白在體外表達過程中極不穩定，因此會導致蛋白在體外不表達或者是形成構象不正確的蛋白。因此單次疏水跨膜區極其不利于蛋白在細胞膜上的穩定性，目前可采取的策略是只將BAK1蛋白的胞外區域進行體外擴增并構建到適當的表達載體上，然后獲得其穩定構象的胞外結構域的蛋白。

蛋白質大分子在生物體內承擔著多種多樣的生理功能，研究蛋白質的結構和功能對于人類了解生理調控、機體代謝具有重要意義，但往往需要在體外獲取具有正確構象及生理功能的重組蛋白，才能保證一系列研究的順利開展和實施成功。原核表達系統很大程度地改善了重組外源蛋白表達量不高以及下游分離加工難度大等問題。其中融合蛋白表達技術的表達模式是：原核啟動子→SD序列→起始密碼子→原核結構基因片斷→目的基因序列→終止密碼子，是比較常用的表達載體，尤其適用于小分子多肽和蛋白的表達。然而由于BAK1蛋白為大分子真核胞外分泌蛋白，采用原核表達系統外源表達BAK1蛋白往往形成包涵體，不能獲得構象正確的蛋白。現有技術采用真核表達系統來生產BAK1蛋白，但都無法獲得正確構象的BAK1蛋白。這遠遠不能滿足后續產業對BAK1蛋白的需求。因此，急需一種能夠提高BAK1蛋白表達量、成本低廉的方法以彌補現有技術的不足。本方法首次成功地在體外獲得正確構象的BAK1蛋白。從無到有的技術突破。

發明內容