[發明專利]一種外源表達FLS2蛋白的方法

在審

• 申請號: 201811280260.3
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109402142A
• 公開（公告）日: 2019-03-01
• 發明（設計）人: 湯嬌;孫亞東;韓志富;柴繼杰;石巍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蜜蜂研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/866;C12N15/66;C07K14/415
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種外源表達FLS2蛋白的方法。該方法包括：在pFastBac^TM1的BamH1酶切位點前加入Hemolin信號肽得到pFastBac^TMHem載體；用BamH1和Sal1酶切FLS2基因，采用BamH1和Xho1酶切pFastBac^TMHem載體，酶切后連接，構建外源表達載體；外源表達載體轉染昆蟲細胞，培養該細胞后，收獲細胞和上清，上清液經層析，純化后獲得構象正確的FLS2蛋白，表達量達2.6mg/L。本發明方法克服了現有技術采用原核表達系統無法獲得正確構象的FLS2蛋白或采用其他真核表達系統FLS2蛋白表達量低的缺點，提高了構象正確的FLS2蛋白的表達量，節約了成本。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體地，涉及一種外源表達FLS2蛋白的方法。

背景技術

植物受體激酶根據胞外識別結構域的不同可以分為很多不同的受體蛋白家族，其中數量最多的研究最為深入的是富亮氨酸重復類受體激酶(leucine-rich repeatsreceptor kinase，LRR-RK)，LRR-RK家族分為16個亞家族。FLS2蛋白屬于XII家族，含有1173個氨基酸，約129KDa，包含N端信號肽、N端帽子LRRNT結構、28個連續規整的LRRs、近膜區、單次跨膜區TM、激酶結構域和一個C末端尾。N-、C-末端有標準的兩個半胱氨酸對，用于帽子結構的形成。

FLS2蛋白是模式植物擬南芥中的受體蛋白激酶，位于細胞表面上，蛋白受體激酶的結構分為一個胞外識別結構域、單次跨膜區和胞內激酶結構域。胞外識別結構域負責識別外源的信號分子，進而激活該受體，引起胞內激酶結構域發生磷酸化，從而將信號由細胞外傳遞至細胞內，引起細胞內的一系列生化反應。FLS2蛋白是植物識別細菌鞭毛蛋白的主受體，該受體在植物體內的缺失會造成植物對細菌的免疫性下降，導致植物被細菌侵染，過表達FLS2蛋白會提高植物對細菌的耐受性，獲得抗病新植株。細菌鞭毛蛋白與FLS2蛋白結合后會激活植物的免疫反應，幫助植物抵抗病菌的入侵，體外獲得FLS2蛋白，可以用于篩選新型的小分子藥物，篩選出可以激活植物免疫反應的小分子藥物，當細菌入侵時，植物可以抵抗細菌的侵害，研制新型抗細菌藥物，促進植物的抗病表型并提高植物的產量。

目前的研究內容主要集中在探究FLS2這類受體蛋白的胞外識別結構域是如何識別胞外的信號源識別后被激活的機制。主要手段是通過X射線衍射技術獲取蛋白的精細三維結構，在分子水平上闡述上述問題。由于FLS2蛋白只有一個疏水的跨膜區，這對于在體外重組該全長蛋白是一個很大的阻礙。由于蛋白的疏水跨膜區是將細胞膜上的蛋白牢牢錨定在細胞膜上的區域，跨膜區越多，蛋白在細胞膜上越穩定，若跨膜區較多的膜蛋白在體外重組過程中可以采用去垢劑等化學試劑來模擬細胞膜，進而成功獲得膜蛋白的體外成功表達，但是對于只有一個疏水跨膜區的蛋白，比如FLS2蛋白，帶有跨膜區的全長蛋白在體外表達過程中極不穩定，因此會導致蛋白在體外不表達或者是形成構象不正確的蛋白。因此單次疏水跨膜區極其不利于蛋白在細胞膜上的穩定性，目前可采取的策略是只將FLS2蛋白的胞外區域進行體外擴增并構建到適當的表達載體上，然后獲得其穩定構象的胞外結構域的蛋白。

蛋白質大分子在生物體內承擔著多種多樣的生理功能，研究蛋白質的結構和功能對于人類了解生理調控、機體代謝具有重要意義，但往往需要在體外獲取具有正確構象及生理功能的重組蛋白，才能保證一系列研究的順利開展和實施成功。原核表達系統很大程度地改善了重組外源蛋白表達量不高以及下游分離加工難度大等問題。其中融合蛋白表達技術的表達模式是：原核啟動子→SD序列→起始密碼子→原核結構基因片斷→目的基因序列→終止密碼子，是比較常用的表達載體，尤其適用于小分子多肽和蛋白的表達。然而由于FLS2蛋白為大分子真核胞外分泌蛋白，采用原核表達系統外源表達FLS2蛋白往往出現蛋白無法表達或形成包涵體，不能獲得構象正確的蛋白?，F有技術采用真核表達系統來生產FLS2蛋白，但表達量都不高，通常在0.4mg/L。這樣的表達量遠遠不能滿足后續產業對FLS2蛋白的需求。因此，急需一種能夠提高FLS2蛋白表達量、成本低廉的方法以彌補現有技術的不足。

發明內容