[發明專利]一種藥用野生稻莖尖的超低溫保存及恢復培養方法

在審

• 申請號: 201811280227.0
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109380216A
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發明（設計）人: 林田;李天菲;楊華;劉鴻艷;韓靜;周莉;魏仕偉;龍萍;羅利軍
• 申請（專利權）人: 上海市農業生物基因中心
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00;A01H4/00
• 代理公司: 上海智力專利商標事務所(普通合伙) 31105
• 代理人: 周濤

1.一種藥用野生稻莖尖的超低溫保存方法，包括如下步驟：

步驟一.田間取樣及組培體系建立：取根狀莖，沖去根部附著泥沙， 用1%多菌靈浸泡1小時后，在清水培養10-20天，取地上部分新萌生的氣生芽；常規消毒后接種，每30天繼代1次;

步驟二.內生菌檢測：將組培苗轉移到含10 g L^-1葡萄糖和5 g L^-1酵母提取物的培養基中培養7-10天，選取未污染的組培苗進接種到含BA及NAA的培養基上，每30天繼代1次;

步驟三.叢生芽誘導：取繼代30天的無菌組培苗無菌組培苗，剝取2-3mm莖尖，放入含TDZ0.5-5mgL^-1 的MS 培養基中，約5-7天誘導出2-3mm的叢生芽；

步驟四.叢生芽預培養：將叢生芽帶基部轉入含蔗糖0.3molL-1及ABA0.5-5mgL-1的培養基上培養1-3天后，轉入0.7molL-1及ABA0.5-5mgL-1的培養基上預培養1-3天;

步驟五.叢生芽包埋：解剖鏡下切取2-3mm的芽，在2-4%的無鈣離子海藻酸鈉溶液中輕蘸，整齊放在5mm×20mm金屬網狀裝載條上，每條裝載條上5-10個芽，將帶芽的裝載條浸入含有0.1-0.3%氯化鈣、0.4 molL-1蔗糖及2moL-1甘油的MS液體培養基（不含NH4+）中，經10-30min固定后，將裝載條在無菌濾紙上吸去多余液體；

步驟六.叢生芽裝載及玻璃化處理：將固定好的帶芽的裝載條放于預處理溶液中裝載16hr后轉入玻璃化保護劑PVS2（不含NH4⁺）中進行2-5hr的冰浴處理；

步驟七.冷凍及解凍洗滌：將帶芽的裝載條迅速投入液氮中保存。

2. 根據權利要求1所述的藥用野生稻帶莖尖幼芽的超低溫保存方法，其特征在于，所述預處理溶液中為含有0.4 molL-1及甘油2moL-1的MS液體培養基，不含NH4⁺。

3.一種藥用野生稻莖尖超低溫保存后的恢復培養方法，其包括如下步驟：

步驟a.解凍時從液氮中取出帶芽的裝載條，立即放入1.2molL-1的（不含NH4⁺）1/2MS液體培養基中中快速解凍2min，并在培養基中洗滌20min;

步驟b.恢復培養：將帶芽的裝載條濾紙上吸干后置于不含激素的1/2MS培養基（不含NH4⁺）中暗培養1天，轉移到含BA及NAA的培養基（不含NH4⁺）上暗培養，待莖尖再生后轉入含BA及NAA的培養基（含NH4⁺）光照培養。