[發明專利]一種藥用野生稻莖尖的超低溫保存及恢復培養方法

在審

• 申請號: 201811280227.0
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109380216A
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發明（設計）人: 林田;李天菲;楊華;劉鴻艷;韓靜;周莉;魏仕偉;龍萍;羅利軍
• 申請（專利權）人: 上海市農業生物基因中心
• 主分類號: A01N3/00
• 分類號: A01N3/00;A01H4/00
• 代理公司: 上海智力專利商標事務所(普通合伙) 31105
• 代理人: 周濤

本發明涉及一種藥用野生稻帶莖尖幼芽超低溫保存及再生植株方法，具體的說，涉及一種藥用野生稻帶莖尖幼芽的超低溫保存方法。屬植物細胞工程技術領域，超低溫保存及再生植株的方法包括如下步驟：1.田間取樣及組培體系建立；2.內生菌的檢測；3.叢生芽的誘導；4.叢生芽的預培養；5.叢生芽的包埋；6.叢生芽的裝載及玻璃化的處理；7.冷凍及解凍洗滌；8.恢復培養。本發明首次提出對藥用野生稻帶莖尖幼芽成功進行超低溫保存，保存后野生稻恢復生長狀況良好。對野生稻及禾本科植物的超低溫保存具有很好的參考價值。

技術領域

本發明涉及一種藥用野生稻莖尖的保存方法，具體的說，涉及一種藥用野生稻帶莖尖幼芽的超低溫保存方法。屬植物細胞工程技術領域。

背景技術

藥用野生稻是原產中國的3種野生稻之一，由于長期生長在惡劣的自然條件下，藥用野生稻經受了各種自然災害和不良環境的自然選擇，是一種很稀缺和重要的野生稻種質資源，由于長期處于野生狀態，經受各種災害和環境的自然選擇，形成了豐富的變異類型，對水稻病蟲害有較強的抗性，對環境有較強的適應性，并具有優質、高產、氮磷高效利用、廣親和及雄性不育等優良基因，是水稻育種和改良的重要遺傳資源，具有極高的科學研究價值。當前迅速惡化的環境和不利的氣候條件及人類現代急速擴張的經濟活動導致了野生稻生境喪失及惡化、棲息地急劇減少；此外野生稻又具有柱頭外露、異交結實率較高、種子休眠性強、落粒性強、發芽率低的生物學特性。這些因素使藥用野生稻種面臨滅絕的危險, 對野生稻遺傳多樣性的保護刻不容緩。目前，對藥用野生稻的保護措施主要有就地保護和遷地保護（即以種子保存的種質厙、以種莖保存的種質圃）。

植物組織與細胞的培養為植物的種質保存開辟了新的途徑。組織培養物能迅速大量繁殖, 再生植株可保持原有的遺傳特性。而超低溫保存（-196℃）下，植物的生物化學活性近乎停止，貯藏過程中的生理和遺傳變化能夠控制在最低限度內，避免了田間保存易受自然災害影響而導致種質變異或毀滅，以及組織培養保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險，被認為是植物遺傳資源長期保存的最優選擇。

關于植物超低溫保存的研究，保存技術的多樣化與簡易化方面不斷取得進步，能夠保存的植物物種數也在不斷地增長，但多數集中在蘋果、櫻桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及馬鈴薯、紅薯、草莓等經濟植物為主的植物遺傳資源的超低溫保存。水稻的超低溫保存自1979年Sala等首先報道水稻懸浮細胞的超低溫保存后，相關研究多集中在組織培養物如懸浮細胞系、愈傷組織、原生質體及胚狀體上，關于水稻完整器官（如莖尖）凍存的報道僅見章志宏等2000年采用程序降溫法對水稻單倍體幼穗離體培養誘導的不定芽進行超低溫保存，得到再生植株。野生稻的超低溫保存技術相關報道更少且集中于國內，如殷曉輝等1996年在普通野生稻、 寬葉野生稻以及瘤粒野生稻愈傷組織超低溫保存研究中首次獲得了凍后再生植株， 實驗證明了野生稻幼穗離體培養物的超低溫保存是稻屬資源保存的有效途徑。譚光軒等采用程序降溫法對野生稻幼穗離體培養誘導植株，直接進行超低溫保存，避開愈傷組織階段減少遺傳變異的危險，但產生的綠芽一周后白化死亡。

野生稻完整器官的凍存，將是今后研究的重點，便由于野生稻莖尖分生組織體積小、生理狀態脆弱，保存中難以成活。林田等首次采取一系列措施，以提高莖尖的抗性，減少各步驟中的損傷，并采用液氮直投而非依賴程序降溫儀的冷凍步驟，建立了普通野生稻的莖尖超低溫保存體系，并于2018年獲得專利（專利號：ZL 201610131944.1），但是尚存在缺點：1.由于野生稻外植體為田間采樣，內生菌污染難以控制。 2. 由于要將幼嫩莖尖由緊密包裹的葉中分離出來，莖尖剝取步驟對操作者技術要求高，工作強度大，且在剝取過程中容易對莖尖造成機械傷害，不利于種質資源的規模保存。 3. 從田間采樣到適宜凍存的材料獲得周期太長，難以獲得大量整齊一致的材料，不利于凍存的數量及質量控制。

發明內容

本發明的目的是提供一種藥用野生稻莖尖的超低溫保存方法,同時還提供一種藥用野生稻莖尖的超低溫保存后的恢復培養方法。

為了實現本發明的目的，本發明一種藥用野生稻帶莖尖幼芽超低溫保存方法，包括如下步驟：