[發明專利]一種制備脫細胞生物組織材料的方法

在審

• 申請號: 201811278649.4
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN111110917A
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 何海紅;尹宗明;趙婧;桂寶珠;陳國明;李雨
• 申請（專利權）人: 上海微創心通醫療科技有限公司
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36
• 代理公司: 上海思捷知識產權代理有限公司 31295
• 代理人: 王宏婧

本發明屬于生物組織材料的技術領域，具體涉及一種制備脫細胞生物組織材料的方法。所述方法包括如下步驟：包括凍融處理、超高壓處理和去核酸三道工序，其中超高壓處理采用的壓力為400?600MPa。與現有技術相比，本發明提供的技術方案采用反復凍融與超高壓結合的方法，可明顯縮短工藝耗時，提高脫細胞效率，另外實驗參數更溫和，減少了對生物支架結構的破壞；本發明實施例中超高壓處理采用的壓力不會導致介質水出現臨界冰現象，可以更好的保留組織結構的完整性和機械性能。

技術領域

本發明屬于生物組織材料的技術領域，具體涉及一種制備脫細胞生物組織材料的方法。

背景技術

由于脫細胞生物組織材料具有低免疫源性、完整的纖維結構和良好的機械強度，因而在醫療器械領域得到了越來越多的關注和應用。

目前，常用的脫細胞方法主要有物理法、酶消化法、酸堿法及化學去垢劑法等。然而，大量研究表明，以上幾種方法存在很多問題：(1)物理法脫細胞效果較差，易導致細胞和DNA殘留，引起機體免疫反應；(2)酶消化法對酶的濃度要求較高，高濃度的酶易導致膠原纖維組織受損，低濃度的酶則難以去除深層細胞，脫細胞效果差；(3)酸堿法中強酸強堿的環境對組織結構破壞較大；(4)化學去垢劑法不僅易破壞生物組織的膠原蛋白結構，殘留的化學去垢劑還容易導致細胞毒性，且漂洗耗時長。因此，開發一種更簡便、高效、安全的脫細胞方法將具有廣泛的應用前景和重要的實用價值。

2006年，上海交通大學醫學院上海兒童醫學中心的殷猛等首次報道了在生物材料制備領域采用超高壓技術進行脫細胞操作。首先將組織置入浸滿MillliQ水的塑料袋中，在超高壓設備中逐步加壓至約980MPa，持續10分鐘，再相繼用酶消化法沖洗，酒精浸泡，PBS沖洗，共耗時11天。這種超高壓脫細胞方法雖然可以完全去除細胞成分，簡便快速，但是該方法中使用的壓力較大，對設備要求高，且制備周期較長。另外，有研究表明高壓會導致蛋白質變性，因此接近1000MPa的超高壓對基質結構的作用還需進一步研究。同時，當壓力高于600MPa時，作為傳壓介質的水會出現臨界冰現象，進而會對膠原纖維造成損傷。

專利CN101185770描述了一種多次逐步增壓的超高壓脫細胞方法。將生物組織連通真空包裝袋放入傳壓介質中，分別經過600MPa，800MPa和1000MPa各5分鐘的超高壓處理后，即可將細胞完全去除，且不破壞蛋白結構。但該過程中多次的逐步增壓工藝較為復雜，對技術要求高；且后續壓力較大，對設備要求高。同時，該過程中操作壓力也均在600MPa及以上，也會出現水的臨界冰現象。另外，超高壓力也會導致組織結構致密性高，孔隙率小，很可能導致脫細胞效果降低。

總之，現有的生物組織脫細胞方法(如物理法、化學去垢劑法等)存在脫細胞不完全、膠原組織受損或殘余物毒性較大等缺點，在工藝上還有待改善和提高。新的超高壓脫細胞的處理工藝雖然有一定的優勢，但是在壓力設備需求、生物組織形態變化及機械性能強化等方面仍需進一步改進。

發明內容

本發明提供了一種制備脫細胞生物組織材料的方法，用以解決目前方法制備脫細胞生物組織材料脫除細胞不完全、組織受損嚴重或殘留毒性物質的問題。

為了解決上述技術問題，本發明的技術方案是：所述制備脫細胞生物組織材料的方法，包括凍融處理、超高壓處理和去核酸三道工序，其中超高壓處理采用的壓力為400-600MPa。

可選地，所述方法具體包括如下步驟：

步驟一，將生物組織上的脂肪剝離并對所述生物組織進行修剪和清洗；

步驟二，凍融處理：將步驟一處理后的生物組織反復凍融多次；

步驟三，超高壓處理：將步驟二處理后的生物組織清洗密封，置于超高壓儀器內進行超高壓處理；

步驟四，去核酸：將步驟三處理后的生物組織，用核酸酶去除細胞殘余核酸組分；