[發明專利]雙向熱循環消減SELEX快速篩選核酸適配體的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201811278330.1
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109280667A
• 公開（公告）日: 2019-01-29
• 發明（設計）人: 廖世奇;袁紅霞;翟蒙;張蕾;田彩平;魏政麗
• 申請（專利權）人: 廖世奇
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115
• 代理公司: 蘭州智和專利代理事務所(普通合伙) 62201
• 代理人: 張英荷

本發明公開一種雙向熱循環消減SELEX快速篩選方法及試劑盒，該方法將納米（瓊脂）磁珠材料、SELEX技術和高通量核酸測序有機結合，建立針對（復合）靶標分子的快速高效核酸適配體篩選技術體系及相應試劑盒。該試劑盒可快速篩選出特異性強、親和力高的核酸適配體。該方法具有快速、高效、成本低、操作簡單、可機械化完成等優點。

技術領域

本發明涉及一種核酸適配體的篩選方法，尤其是涉及一種將納米磁珠材料、SELEX技術和高通量核酸測序有機結合，建立雙向熱循環消減SELEX快速篩選（復合）靶分子核酸適配體的方法；本發明同時還涉及一種雙向熱循環消減SELEX快速篩選（復合）靶分子核酸適配體的試劑盒。

背景技術

SELEX技術，即指數富集的配基系統進化技術（SystematicEvolution of Ligandsby Exponential Enrichment，SELEX），利用該技術可以從隨機單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質高度親和的核酸適體（Aptamer）。自Tuerk等首先運用此技術篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機染料分子的特異寡核苷酸配基后，經過二十多年的發展，SELEX技術已經成為一種重要的研究手段和工具，被應用于生物化學、基因調控、疾病診斷及新藥研發等領域。隨著篩選的靶標越來越廣泛，從最開始的有機染料和酶逐漸擴展到更小的離子、氨基酸、毒素以及更復雜的癌細胞、干細胞、臨床組織切片、血清等，對于不同的靶物質，有必要采用適當的方法，才可以更快更方便地找到親和力高、特異性強的適配體。

近年來，研究者在原有篩選方法的基礎上將石墨烯，碳納米管，毛細管，流式細胞儀，原子力顯微鏡等不同的材料和儀器引入了分離步驟以提高分離效率，使經典的SELEX技術得到發展和完善，衍生出了眾多改良的SELEX技術如：反向篩選（counter SELEX）、消減篩選（subtractive SELEX）、毛細管電泳篩選（CE SELEX）、基因組SELEX（genomic SELEX）、加尾篩選（tailored SELEX）、切換篩選（toggle SELEX）和基于修飾核苷酸的SELEX等。這些方法的建立，提高了篩選效率，豐富了核酸適配體的應用形式，為核酸適配體的研究和應用奠定了基礎。但是，這些篩選方法都存在一定的局限性，如篩選成本高、周期長、操作復雜，針對的靶標單一等。因此建立一種成本較低、操作簡單、快速、高效的核酸適配體篩選技術具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種雙向熱循環消減SELEX快速篩選核酸適配體的方法，可用于血清、細胞、組織、細菌和病毒等樣品的篩選。

一、雙向熱循環消減SELEX快速篩選方法

本發明雙向熱循環消減SELEX快速篩選核酸適配體的方法，包括以下步驟：

（1）靶磁珠制備：分別將捕捉磁珠與目標靶分子、消減靶分子混合，在37±0.3℃孵育30min分鐘，洗滌緩沖液洗1次，形成磁珠-目標靶、磁珠-消減靶；再分別加入蛋白封閉液，37±0.3℃封閉1h小時后去上清，用洗滌緩沖液洗至無泡沫，分離磁珠中加入pH值為7.4的1×Binding buffer緩沖液，含0.1%的疊氮鈉。

所述目標靶分子為單一分子、多種分子混合物、以及血清、細胞、組織、細菌和病毒裂解懸液中的一種；所述消減靶分子為靶分子中重復需要消除的對應分子。

所述瓊脂磁珠，其結構是由瓊脂包裹順磁磁鐵（四氧化鐵）周圍，經脫脂奶粉封閉，外加活性基團，如羧基、環氧基、氨基等活性基團，具有很好的結合生物分子的能力。瓊脂磁珠通過化學鍵與蛋白質等生物分子結合，并通過結合的生物分子與其他分子發生酶催化、免疫、配體配基等反應，并且與核酸的非特異性吸附少。瓊脂磁珠微粒的制備如下：