[發明專利]雙向熱循環消減SELEX快速篩選核酸適配體的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201811278330.1
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109280667A
• 公開（公告）日: 2019-01-29
• 發明（設計）人: 廖世奇;袁紅霞;翟蒙;張蕾;田彩平;魏政麗
• 申請（專利權）人: 廖世奇
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115
• 代理公司: 蘭州智和專利代理事務所(普通合伙) 62201
• 代理人: 張英荷

1.一種雙向熱循環消減SELEX快速篩選核酸適配體的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）靶磁珠制備：分別將捕捉磁珠與目標靶分子、消減靶分子混合，在37±0.3℃孵育30min分鐘，洗滌緩沖液洗1次，形成磁珠-目標靶、磁珠-消減靶；再分別加入蛋白封閉液，37±0.3℃封閉1h小時后去上清，用洗滌緩沖液洗至無泡沫，分離磁珠中加入pH值為7.4的1×Binding buffer緩沖液，含0.1%的疊氮鈉；

（2）雙向消減結合：將隨機ssDNA庫用結合緩沖液溶解，95℃加熱5min并置于冰水中迅速冷卻；

正向結合：第一輪消減結合：將隨機寡核苷酸文庫先和磁珠-消減靶復合物37℃結合1h，磁分離，吸出上清；將上清加入到磁珠-目標靶復合物中，37℃結合1h，用0.5mL洗滌緩沖液充分搖動，洗滌3次，去除未結合的非特異性分子；在磁珠中加入結合緩沖液，95℃加熱5min，重復3次，混合吸出的上清，上清為第一輪次級文庫；從第二輪開始，將次級文庫先與磁珠-目標靶復合物結合，磁分離棄上清，用0.5mL洗滌緩沖液充分搖動，洗滌3次，去除未結合的非特異性分子；在結合目標靶的磁珠中，加入結合緩沖液，95℃加熱5min，重復3次，混合吸出的上清，加入磁珠-消減靶復合物中，37℃結合1h，磁分離，吸出上清為次級文庫；

反向結合：將磁珠-消減靶復合物視為目標靶，磁珠-目標靶復合物為消減靶進行結合，結合過程同正向結合；

（3）洗滌：用洗滌緩沖液充分搖動，洗滌3次，去除未結合的非特異性分子；

（4）洗脫：加入洗脫緩沖液洗結合有靶分子的磁珠3次后，磁分離，在磁珠中加入1×PCRBuffer，95℃加熱 5分鐘，磁分離，吸取上清，重復加熱 3次，收集上清混勻；

（5）次級文庫的制備：實時熒光定量-PCR對前輪篩選消減獲得的ssDNA進行富集檢測后，用不對稱PCR方法和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳切膠制備次級文庫：以步驟（1）所述次級文庫上清為模板DNA，PCR擴增16~20個循環后，得到第一輪篩選產物；再以篩選產物為模板，不對稱PCR擴增20~30個循環，取PCR產物進行變性PAGE凝膠電泳，切取單鏈條帶，粉碎，加入洗脫緩沖液 300μL，95℃加熱5min，3000r/min離心收集上清，重復3次；將上清加入3000Dr超濾管中，超濾20min，得到ssDNA次級文庫；

（6）循環篩選：重復步驟（1）-（5），篩選7~15輪，每輪用實時定量-PCR檢測次級庫對目標靶和消減靶的結合量，確定富集程度，制備適配體富集文庫；

（7）對適配體富集文庫進行高通量測序。

2.如權利要求1所述一種雙向熱循環消減SELEX快速篩選核酸適配體的方法，其特征在于：步驟（1）中，所述目標靶分子為單一分子、多種分子混合物、以及血清、細胞、組織、細菌和病毒裂解懸液中的一種；所述消減靶分子為：在靶分子混合物中，除靶分子外需要消除的分子。

3.如權利要求1所述一種雙向熱循環消減SELEX快速篩選核酸適配體的方法，其特征在于：步驟（1）中，所述捕捉磁珠特征在于：所述捕捉磁珠的結構是由瓊脂包裹順磁磁鐵，在瓊脂外有環氧基、羧基、NHS磁珠、鏈霉親合素、核酸適配體、抗體中的一種，可有效的偶聯靶分子，或靶分子混合物的磁珠。

4.如權利要求1所述一種雙向熱循環消減SELEX快速篩選核酸適配體的方法，其特征在于：步驟（1）中，所述蛋白封閉液為pH=7.4的0.01M PBS，其中含2%蔗糖、1％BSA、1%酪蛋白，0.5%疊氮鈉，4℃保存。

5.如權利要求1所述一種雙向熱循環消減SELEX快速篩選核酸適配體的方法，其特征在于：步驟（2）中，所述隨機寡核苷酸ssDNA庫中，每個分子序列長為80-150個堿基，其兩端是固定引物，中間有25-60個隨機核酸序列，并由10^12-14個分子組成。

6.如權利要求1所述一種雙向熱循環消減SELEX快速篩選核酸適配體的方法，其特征在于：步驟（2）中，所述結合緩沖液為pH值為7.4的1×Binding buffer緩沖液。