[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)軟骨素的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811277262.7
• 申請(qǐng)日: 2018-10-30
• 公開（公告）號(hào): CN109486734B
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于慧敏;成方宇;羅榆盛;王苗苗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/77;C12P19/26;C12R1/15
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

本發(fā)明公開了屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域的一種生產(chǎn)軟骨素的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。所述生產(chǎn)軟骨素的基因工程菌，其是將軟骨素合成酶基因和UDP?葡萄糖胺異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)入至谷氨酸棒桿菌而得到的。本發(fā)明提供的生產(chǎn)軟骨素的基因工程菌，以谷氨酸棒桿菌為宿主，為美國(guó)食品藥物管理局認(rèn)定的GRAS菌株，其本身不分泌任何內(nèi)毒素和外毒素，安全，可以長(zhǎng)期被應(yīng)用于氨基酸或食品添加劑等的生產(chǎn)，其生產(chǎn)的軟骨素具有較高的分子量，并且較好的產(chǎn)量。本發(fā)明的基因工程菌的優(yōu)選重組菌的軟骨素產(chǎn)量達(dá)3.7g/L，且均為高分子量的軟骨素產(chǎn)物，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景及醫(yī)藥和保健用途。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生產(chǎn)軟骨素的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate,CS)，是廣泛存在于哺乳動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中的一種硫酸化粘多糖。其骨架是由D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid,GlcA)和N-乙酰-半乳糖胺(N-acetylgalactosamine,GalNAc)交替連接的線性多糖軟骨素。根據(jù)其硫酸化位點(diǎn)的不同，可以分為CS-O,A,B,C,D,E等不同種類。由于CS優(yōu)秀的生物相容性以及在人體生理活動(dòng)中扮演的重要角色，其應(yīng)用范圍相當(dāng)廣泛，主要包括醫(yī)療健康和食品化妝品領(lǐng)域。在臨床醫(yī)藥領(lǐng)域，CS主要應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎預(yù)防和治療。除此以外，新的研究表明CS還具有抗腫瘤活性。在化妝品領(lǐng)域中，CS能改善肌膚干燥、延緩衰老產(chǎn)生的皮膚問題。

目前，CS在工業(yè)中主要的生產(chǎn)方法是動(dòng)物組織提取法。原料來源主要是動(dòng)物的軟骨組織如牛氣管、豬鼻中隔以及鯊魚軟骨等。該方法還存在較多的問題，比如原料生產(chǎn)周期長(zhǎng)、產(chǎn)業(yè)水平有限、潛在的動(dòng)物病毒傳染以及環(huán)境污染等問題，成為CS的產(chǎn)業(yè)規(guī)模發(fā)展的瓶頸。

隨著微生物技術(shù)的發(fā)展，更加高效安全的發(fā)酵方法有望替代動(dòng)物組織提取法來生產(chǎn)硫酸軟骨素。

硫酸軟骨素的前體是軟骨素。軟骨素在體外經(jīng)酶通過磺化反應(yīng)即可獲得硫酸軟骨素。自然界中野生的大腸桿菌K4(尿路致病菌)可以直接合成硫酸軟骨素的類似物——果糖軟骨素。產(chǎn)物經(jīng)過脫果糖和磺化兩個(gè)步驟可以得到硫酸軟骨素。經(jīng)過基因工程改造，大腸桿菌K4的果糖軟骨素產(chǎn)量從3.99g/L(中國(guó)發(fā)明專利CN107312738A)提高到8.4g/L(QuanZhang等,Metab Eng,2018,47:314-322)，分子量由8kDa和150kDa兩部分組成。但由于從果糖軟骨素制備軟骨素，需要經(jīng)過脫果糖這一額外步驟，很多研究人員致力于硫酸軟骨素和軟骨素的其它生物合成方法研究，例如篩選新的野生菌株及構(gòu)建基因工程新菌株。中國(guó)發(fā)明專利CN102220270A公開了從自然界中篩選直接生產(chǎn)硫酸軟骨素的野生枯草芽孢桿菌來合成硫酸軟骨素的方法，產(chǎn)量為0.18g/L。中國(guó)發(fā)明專利CN105779532A公開了巨大芽孢桿菌合成硫酸軟骨素的方法，其產(chǎn)量為0.13g/L。另一方面，在構(gòu)建基因工程菌株來合成軟骨素的研究中，中國(guó)發(fā)明專利CN106497845A公開了在枯草芽孢桿菌中引入來自大腸桿菌K4的軟骨素合成酶(KfoC)和UDP-葡萄糖胺異構(gòu)酶(KfoA)基因kfoC和kfoA重組合成軟骨素的方法，產(chǎn)量為1.83g/L。進(jìn)一步強(qiáng)化底物的合成基因(tuaD，glmM和kfoA)，并優(yōu)化培養(yǎng)條件，胞外軟骨素產(chǎn)量提高到7.15g/L，分子量為85kDa(Zhengxiong Zhou等,Biotechnol Bioeng,2018:1-10)。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)是一類好氧細(xì)菌，細(xì)胞呈短桿或小棒狀，為革蘭氏陽(yáng)性。2003年，谷氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組測(cè)序工作完成(http://gib.genes.nig.ac.jp/)。谷氨酸棒桿菌作為美國(guó)食品藥物管理局認(rèn)定的GRAS(一般認(rèn)為安全)菌株，長(zhǎng)期被應(yīng)用于氨基酸或食品添加劑等的生產(chǎn)。其本身不分泌任何內(nèi)毒素和外毒素。到目前為止，未見有利用谷氨酸棒桿菌作為宿主，來制備軟骨素及其衍生物的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容