[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)軟骨素的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811277262.7
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109486734B
• 公開（公告）日: 2021-12-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 于慧敏;成方宇;羅榆盛;王苗苗
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/77;C12P19/26;C12R1/15
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

1.一種生產(chǎn)軟骨素的基因工程菌，其是將軟骨素合成酶基因和UDP-葡萄糖胺異構(gòu)酶基因轉(zhuǎn)入至谷氨酸棒桿菌而得到的；所述軟骨素合成酶的基因的核酸序列如序列表SEQ IDNo. 1所示，所述UDP-葡萄糖胺異構(gòu)酶的基因的核酸序列如序列表SEQ ID No. 2所示; 所述谷氨酸棒桿菌為乳酸脫氫酶基因失活的谷氨酸棒桿菌ATCC13032。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述軟骨素合成酶和UDP-葡萄糖胺異構(gòu)酶來源于大腸桿菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒桿菌中的UDP-葡萄糖脫氫酶基因過表達(dá)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，使谷氨酸棒桿菌中的UDP-葡萄糖脫氫酶基因過表達(dá)的方法為轉(zhuǎn)入UDP-葡萄糖脫氫酶基因。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，轉(zhuǎn)入的軟骨素合成酶基因、UDP-葡萄糖胺異構(gòu)酶基因或UDP-葡萄糖脫氫酶基因受誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動子控制。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動子為Ptac啟動子。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述軟骨素合成酶基因、UDP-葡萄糖胺異構(gòu)酶基因或UDP-葡萄糖脫氫酶基因通過重組載體轉(zhuǎn)入。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述重組載體的原始質(zhì)粒為pXMJ19、pEC-XK99E或pJC1。

9.一種生產(chǎn)軟骨素的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括步驟如下：

1）在軟骨素合成酶基因和UDP-葡萄糖胺異構(gòu)酶基因之前分別添加核糖體識別序列，擴(kuò)增得到含有軟骨素合成酶基因和UDP-葡萄糖胺異構(gòu)酶基因的片段；所述軟骨素合成酶的基因的核酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示，所述UDP-葡萄糖胺異構(gòu)酶的基因的核酸序列如序列表SEQ ID No. 2所示;

2）將上述含有軟骨素合成酶基因和UDP-葡萄糖胺異構(gòu)酶基因的片段置于強(qiáng)啟動子控制之下，構(gòu)建重組載體；

3）將重組載體轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌中，得到基因工程菌；所述谷氨酸棒桿菌為乳酸脫氫酶基因失活的谷氨酸棒桿菌ATCC13032；

或者，在步驟2）后選擇進(jìn)行4）將上游含有核糖體識別序列的UDP-葡萄糖脫氫酶的基因片段插入步驟2）的重組載體，置于強(qiáng)啟動子控制之下；然后進(jìn)行步驟3）。

10.權(quán)利要求1-8任一項所述的基因工程菌在制備軟骨素或其衍生物中的應(yīng)用。

11.一種發(fā)酵法生產(chǎn)軟骨素的方法，其特征在于，包括步驟如下：

1）將權(quán)利要求1-8任一項所述的基因工程菌接入LB液體培養(yǎng)基中，在25-40℃、搖床轉(zhuǎn)速為100-300 rpm/min的條件下培養(yǎng)10-30小時，得到重組菌菌液；

2）按照1-20%的體積百分比將步驟1）得到的重組菌菌液接入發(fā)酵罐中，在25-40℃、pH控制在6.0-8.0、攪拌槳轉(zhuǎn)速為300-600rpm/min的條件下培養(yǎng)1-5小時，加入誘導(dǎo)劑后，繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時，通過流加的方法維持糖濃度在5-10 g/L，得到菌體，破碎菌體后，提純得到軟骨素。