[發明專利]一種人類2型糖尿病相關基因突變篩查的組合引物及應用

在審

• 申請號: 201811276265.9
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109295210A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 鄶斌;毛燕;李潔璇;操立超;侯俊笛
• 申請（專利權）人: 深圳市萬眾基因轉化醫學研究院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/11
• 代理公司: 合肥中博知信知識產權代理有限公司 34142
• 代理人: 李德勝

1.一種人類2型糖尿病相關基因突變篩查的組合引物，其特征在于：所述組合引物包括針對人類2型糖尿病在chr1、chr2、chr3、chr4、chr6、chr7、chr10、chr11、chr12、chr15、chr16、chr19、chr20染色體上ALPK1基因上的rs2074379和rs2074388位點，APOE基因上的rs405509位點，ARNTL2基因上的rs7958822位點，CCDC33基因上的rs2930291位點，CDKAL1基因上的rs4712523和rs9465871位點，CLOCK基因上的rs1801260位點，CYBA基因上的rs4673位點，ENPP1基因上的rs1044498和rs997509位點，FABP2基因上的rs1799883位點，FAM78B基因上的rs2116519位點，FTO基因上的rs7193144位點，GC基因上的rs4588位點，HIGD1C基因上的rs12304921位點，KCNJ11基因上的rs5215和rs5219位點，KCNQ1基因上的rs151290位點，NFE2L2基因上的rs6721961位點，NOS3基因上的rs3918188位點，PAX4基因上的rs2233580位點，PDE4B基因上的rs4655595位點，PPARG基因上的rs1801282位點，PRKAA2基因上的rs2746342位點，RBMS1基因上的rs6718526位點，TCF7L2基因上的rs11196205、rs11196218、rs4506565和rs7901695位點，TPCN2基因上的rs1551305位點，TRIB3基因上的rs2295490位點，UCP2基因上的rs660339位點，ZFAND6基因上的rs2903265位點，以及ZNF239基因上的rs9326506位點；所述組合引物包含了所有所選位點的正向引物和反向引物，如chr1染色體上rs1044498位點的引物包含了正向引物序列SEQ ID NO:1和反向引物序列SEQID NO:2，其它位點的引物序列詳見引物序列表。

2.權利要求1所述的組合引物在制備人類2型糖尿病相關基因突變篩查試劑盒中的應用。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括權利要求1所述的組合引物和一組包含飽和染料的PCR反應mix，所述組合引物的序列如SEQ ID NO:1-70所示。

4.權利要求3所述的試劑盒在人類2型糖尿病相關基因突變篩查中的應用。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，包括以下步驟：

1)樣品采集、DNA提取和PCR擴增引物的設計：所述擴增引物設計為權利要求1所述的組合引物；

2)高分辨率溶解熒光定量PCR擴增上述組合引物：將步驟1)中不同的組合引物按照等比例混合，混合后作為一個的引物池，按照試劑盒要求配置反應體系，體系如下：

用此引物按照熒光定量PCR的方法進行擴增，擴增條件如下：95℃預變性10min；然后按95℃變性10s，65-55℃退火10s，每個循環下降0.5℃，72℃延伸30s的程序進行45個循環；擴增出的DNA片段即為擴增文庫；

3)步驟2)中的DNA片段按照高分辨率熔解曲線法進行高分辨率溶解曲線過程，擴增產物的熔解步驟在PCR循環結束后立即進行，程序為：升溫至95℃1min，然后降溫至40℃1min，再升溫至65℃1s，從65℃連續升溫到95℃的過程中進行熒光收集，25次/℃，最后，降溫至40℃。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于：所述組合引物為35對組合引物，所述上游組合引物與下游組合引物之間的退火溫度3度內，且引物對與引物對之間形成的引物二聚體的△G的絕對值小于5。