[發明專利]一種CHO細胞基因組內NW_006880285-1穩定表達蛋白質的應用

有效

• 申請號: 201811274680.0
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109337927B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 金堅;李華鐘;周松濤;陳蘊;段作營;龔笑海
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N5/10
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 何金錦

本發明公開了一種CHO細胞基因組內NW_006880285?1穩定表達蛋白質的應用,所述CHO細胞基因組內用于穩定表達蛋白質的位點位于CHO細胞基因NW_006880285.1的第1235357堿基處；所述位點附近1235284?1235429范圍內可被CRISPR/Cas9技術識別的5'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG3'為靶序列。本發明申請在CHO細胞基因組內的固定位置，導入不同蛋白質基因，并進行穩定表達。

技術領域

本發明涉及基因技術領域，尤其是涉及一種用于穩定表達蛋白質的CHO細胞重組基因。

背景技術

中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary cell,CHO)作為生物制藥領域的主力細胞系，已經被開發出許多不同種類的CHO細胞系，包括可以用來擴大基因拷貝數的細胞系。然而，轉基因拷貝數的增多與目的蛋白質產率提高并不是明確的正相關關系。且即使蛋白質表達增多，多數CHO細胞的表達水平不穩定。當前普遍使用的構建穩定轉染細胞的方法耗時耗力，主要是因為需要重復大量的單克隆篩選過程，所以當前在細胞系構建領域普遍期待可以開發出一種能在短時間內，獲得高表達及穩定表達的細胞的方法，并且能夠確保構建出來的重組細胞系與傳統方法相比，有相同的質量水平，以確保監管機構的批準。

傳統構建外源蛋白質表達細胞系的方法是通過外源基因隨機整合到細胞基因組上，再經過系列的高表達單克隆細胞篩選，獲得外源蛋白質高表達細胞系。由于位點效應差異的多樣性，隨機整合產生的重組細胞表達水平各異，因此需要后期花費很長的時間和很多的步驟，用于挑選高表達單克隆細胞。通過隨機整合獲得的單克隆細胞無法保證多肽/蛋白質在細胞傳代中穩定表達，每進行一次重組細胞構建均需要反復進行單克隆篩選，增加了生物制藥的研發成本。

位點效應妨礙著傳統隨機整合構建重組細胞系的效率，反復的高表達單克隆篩選費時費力，且成本昂貴。如何克服位點效應，利用定點整合技術，快速高效地獲得穩定表達單克隆細胞已經在學術界被討論了多年，一直未有突破性進展。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明申請人提供了一種CHO細胞基因組內某位點穩定表達蛋白質的應用。本發明申請在CHO細胞基因組內的固定位置，導入不同蛋白質基因，并進行穩定表達；此外在實現該定點整合的過程中，無需多次挑選單克隆以獲得更高的表達細胞株，節省了大量的時間。

本發明的技術方案如下：

一種CHO細胞基因組內某位點穩定表達蛋白質的應用，所述CHO細胞基因組內用于穩定表達蛋白質的位點位于CHO細胞基因NW_006880285.1的第1235357堿基處；

所述位點附近1235284-1235429范圍內可被CRISPR/Cas9技術識別的5'NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG3'為靶序列。

所述蛋白質為分子量小于160KDa的蛋白質。

所述蛋白質為多肽、功能性蛋白質、抗體、融合蛋白質中的一種。

所述靶序列為CHO細胞基因NW_006880285.1的第1235357堿基處上游第1235285-1235307堿基處；所述靶序列為5’-GAAAGAAGGTCTGATATCAAAGG-3’。

優選方案，所述靶序列為5’-AAAGAAGGTCTGATATCAAAGGG-3’。

優選方案，所述靶序列為5’-CCTCACTAGTACACGCACCATGG-3’。

優選方案，所述靶序列為5’-TAGCTTGCTCACAGTAGCACAGG-3’。

優選方案，所述靶序列為5’-CTTGCTCACAGTAGCACAGGAGG-3’。

優選方案，所述靶序列為5’-GCTCACAGTAGCACAGGAGGAGG-3’。