[發明專利]家畜血細胞制備動物細胞培養液的方法及其制得的動物細胞培養液的應用

在審

• 申請號: 201811274111.6
• 申請日: 2018-10-30
• 公開（公告）號: CN109468262A
• 公開（公告）日: 2019-03-15
• 發明（設計）人: 李勇;陳曄洲;段生寶;王紅梅;丁少華;魏雙施
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 韓飛

本發明公開了一種家畜血細胞制備動物細胞培養液的方法，包括以下步驟：將牛、羊、馬、豬或其他家畜采全血后經離心、自然沉降或淋巴細胞分離液等方法分離得到血細胞；然后采用反復凍融法或超聲法裂解血細胞，離心收集上清液，經微孔濾膜過濾后得到血細胞裂解液。本發明還公開了該方法制得的動物細胞培養液的應用，培養動物細胞時，將由所述方法制得的血細胞裂解液作為動物細胞培養液完全或部分替代牛血清，以5％?30％的比例添加到商品化的基本培養基中。與胎牛血清和新生牛血清相比，本發明制備的細胞培養基不但能有效的促進細胞增殖，而且批次間一致性高，價格低廉，來源廣泛，不存在動物倫理的爭議。

技術領域

本發明涉及細胞培養基領域，特別涉及一種家畜血細胞制備動物細胞培養液的方法及其制得的動物細胞培養液的應用。

背景技術

各種動物來源細胞的體外培養是生命科學研究的重要組成部分，也被認為是一種重要的動物實驗替代方法。細胞在體外的生存環境是人工模擬的，除需無菌、溫度、空氣等條件外，最主要的是培養基，它供給細胞生長所需要的營養物質。目前對細胞生長所需的營養成分尚未完全搞清楚，因此需要加入一些天然的成分，否則細胞很難良好的生長。動物血清，尤其是牛血清，是動物來源細胞培養中用量最大的天然培養基。血清的生物學效應早已證明，它含有多種促細胞生長因子、促黏附因子、激素及其他活性物質。而且血清能中和有毒物質的毒性，使細胞不受傷害。

目前用于動物來源細胞培養的天然培養基主要以胎牛血清或新生牛血清為主。胎牛血清是在母牛懷孕五至八月齡時，剖腹產將胎牛取出，在沒有任何麻醉措施的條件下進行心臟穿刺取血。為了保證收集到較多量的血清并保證所收集的血清質量，在采血的過程中需要保證胎牛是活的，心臟取血可能造成胎牛的痛苦，因此胎牛血清的使用一直存在動物倫理和科學的爭議。每頭胎牛只能取得約0.5升的血清，產量低，成本高，因此其價格相當昂貴。新生牛血清是出生12-24小時的新生牛靜脈采血所得，同樣產量較低，價格雖然比胎牛血清便宜，但是隨著需求量的增加，價格也不斷攀升。此外，牛血清還存在批次間差異較大，性能不穩定的缺點。因此，開發適用于動物來源細胞培養的替代牛血清的優質培養基符合當前的發展需求。

牛、羊、馬、豬等家畜的血液來源豐富，可以從中提取血細胞裂解液。血液中白細胞可釋放出多種細胞因子，如白細胞介素、集落刺激因子、轉化生長因子等。血小板的作用是凝聚在損傷部位，協助凝血機制，并釋放生長因子以及其他介質促進傷口愈合。血小板經裂解后可釋放出多種生長因子，如血小板衍生生長因子、轉化生長因子、胰島素樣生長因子、基質細胞衍生因子-1、血管內皮生長因子等。這些生長因子參與許多不同的細胞功能，可以促進動物來源細胞的生長和增殖。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于針對上述現有技術中的不足，提供一種家畜血細胞制備動物細胞培養液的方法及制得的動物細胞培養液的應用。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種家畜血細胞制備動物細胞培養液的方法，包括以下步驟：將牛、羊、馬、豬或其他家畜采全血后經離心、自然沉降或淋巴細胞分離液等方法分離得到血細胞；然后采用反復凍融法或超聲法裂解血細胞，離心收集上清液，經微孔濾膜過濾后得到血細胞裂解液。

優選的是，其中，所述微孔濾膜選用0.22μm膜。

優選的是，包括以下步驟：

1)將牛、羊、馬、豬或其他家畜采全血后收集在含有抗凝劑的血袋中；

2)經離心、自然沉降或淋巴細胞分離液等方法分離得到血細胞(包括白細胞或血小板)；

3)裂解血細胞；

4)4000g下離心20分鐘，收集上清液；

5)將所得溶液經過0.22μm膜過濾，制備得到血細胞裂解液，-20℃保存備用。

優選的是，其中的血細胞為白細胞或血小板。