[發明專利]測定人血清中萬古霉素和降解產物濃度的方法

在審

• 申請號: 201811272243.5
• 申請日: 2018-10-26
• 公開（公告）號: CN111103363A
• 公開（公告）日: 2020-05-05
• 發明（設計）人: 范亞新;陳淵成;張菁;郁繼誠;彭小林
• 申請（專利權）人: 復旦大學附屬華山醫院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.測定人血清中萬古霉素和降解產物CDP-1濃度的方法，其特征在于，采用高效液相色譜-紫外法測定標準品中CDP-1-m、萬古霉素和CDP-1-M的含量，配制相應比例的萬古霉素和降解產物標準曲線及質控樣品，待測樣品經預處理后，經酸性流動相在色譜柱上分離，用串聯質譜檢測，包括以下步驟：

1)CDP-1標準品中CDP-1-m、CDP-1-M和萬古霉素的含量測定

采用通用型的C18液相色譜柱，高效液相系統采用通用型高壓泵、進樣器和紫外檢測器，采用乙腈∶磷酸二氫鉀緩沖液(5mM，含0.023％磷酸)為9∶91，v/v作為流動相，等度洗脫；

2)血清樣品預處理

取待測樣品于離心管中，加入內標工作液、一定濃度的甲酸水溶液，混勻，加入定量的有機試劑沉淀蛋白，13000rpm離心后，吸取定量上清液，加入5％的乙腈水溶液，混勻待測；

3)樣品分離

采用Waters通用型超高效液相色譜柱，填料為亞乙基橋雜化顆粒C18柱，液相色譜系統為超高壓高分辨率計量泵、控溫柱溫箱和自動進樣器，采用乙腈和0.1％甲酸溶液作為流動相，梯度洗脫；

4)樣品檢測

采用通用型串聯質譜檢測器檢測樣品中萬古霉素、CDP-1和內標的峰面積；

質譜電離方式：電噴霧電離源；掃描方式：多反應監測(MRM)正離子模式；離子通道：m/z726.2→m/z 144.2(萬古霉素，CDP-1)和m/z 718.2→m/z 144.2(內標)；

5)濃度計算

以樣品濃度為X軸，待測物峰面積(As)與內標峰面積(Ai)比值為Y軸，進行加權回歸分析，標準曲線回歸方程以及樣品的濃度使用含量分析軟件進行計算。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中色譜柱為Phenomenex LunaC18柱(150×4.6mm，5μm)。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中紫外檢測器的吸收波長為230nm。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中采用去甲萬古霉素作為內標工作液，濃度為25μg/mL。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中所述甲酸水濃度為10％，所述有機試劑為乙腈。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中色譜柱為Waters AcquityBEH C18(2.1×100mm，1.7μm)，流動相為乙腈：0.1％甲酸水，梯度為0.01～3.5min，5～15％乙腈，3.5～3.6min，15～90％乙腈，3.6～4.1min，90％乙腈，4.1～4.4min，90～5％乙腈，4.4～5.0min，5％乙腈。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4)中質譜設定參數為：氣簾氣30Arb；碰撞活化解離(CAD)8；電噴霧電壓5500V；離子源溫度500℃；離子源氣體1和2均為50psi。萬古霉素、內標的碰撞能量均為18V，CDP-1碰撞能量為23V；去簇電壓為100V；射入電壓為10V；掃描時間為80ms。