[發明專利]一種檢測EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201811269530.0
• 申請日: 2018-10-29
• 公開（公告）號: CN109385476A
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發明（設計）人: 包文靜;金安娜;龔偉;高伙妮
• 申請（專利權）人: 上海睿璟生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及基因突變檢測領域，公開了一種檢測EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒，包括核酸擴增試劑和對照品，所述核酸擴增試劑包括EGFR T790M反應液，所述反應液中含有用于檢測EGFR基因T790M突變的特異性引物和熒光探針，所述反應液中還包含一對上游引物和下游引物以及MGB熒光探針；所述核酸擴增試劑還包括2×QuantStudio 3D Digital PCR Mix。本發明還公開了上述檢測EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒的檢測方法的檢測方法。本申請的試劑盒采用數字PCR技術，可對非小細胞肺癌患者組織或血漿DNA樣本中的T790M突變進行定量檢測，從而輔助患者的靶向用藥治療方案的制定。

技術領域

本發明涉及基因突變檢測領域，具體是一種檢測EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒及其檢測方法。

背景技術

肺癌一直以來位居全球癌癥相關死亡首位。美國癌癥協會發布的數據顯示，2014年全美新發肺癌224210例，位居癌癥第二位，其中非小細胞肺癌占80％。盡管化療取得了一些進步，但目前以鉑類為基礎的最有效化療方案的中位生存時間也不會超過10個月。近年來，EGFR絡氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)的廣泛應用使非小小細胞肺癌的治療獲得很大進步。目前第一代EGFR絡氨酸激酶抑制劑吉非替尼和厄洛替尼廣泛應用于NSCLC的治療。它們可逆地與ATP結合位點結合，從而阻止了EGFR下游通路的激活。

雖然在EGFR-TKI使用之初效果顯著，但是多數患者最終都會在使用后9-10個月發生耐藥或病情進展。在2005年對于EGFR-TKI耐藥患者的病例分析中首次提到了T790M突變。耐藥后標本的20外顯子上密碼子790中的C到T堿基的突變使得相應蘇氨酸(T)被甲硫氨酸(M)取代，此關鍵位置的氨基酸的改變使得已有的L858R突變的激酶結構域對ATP親和力反超EGFR-TKI，使EGFR-TKI在和ATP的競爭中處于弱勢而無法繼續阻斷EGFR的信號通路，即表現為耐藥或疾病進展。

最近幾年，針對該突變的以奧希替尼為代表的第三代TKI進入大家的視線，由于其臨床療效及可耐受的毒副作用，FDA加速審批，批準其可作為一代TKI耐藥后的治療策略。奧希替尼一種不可逆的三代EGFR-TKI，可以選擇性地抑制EGFR敏感突變和T790M突變。2017年3月，奧希替尼在華上市，開創了EGFR-TKI耐藥后T790M陽性患者的精準治療新時代。隨著該藥物的上市，如何敏感、準確地檢測T790M突變成為臨床關注的熱點。

《2016年的晚期原發性肺癌診治專家共識》建議有條件的患者在疾病進展時應再次進行腫瘤組織活檢，并進行病理和相關的基因檢測以明確耐藥的性質。目前，T790M檢測方法主要包括：①擴增阻滯突變系統法(amplified refractory mutation system，ARMS)；②聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)；③二代測序法(next-generationsequencing，NGS)。ARMS法只能檢測已知突變，方便快捷、特異度高，在臨床廣泛應用；而NGS是近年發展起來的高通量深度測序技術群，可一次性對幾百萬條至十億條DNA分子進行并行測序，但對稀有突變及結構變異不敏感且價格昂貴，廣泛應用仍受到限制。在標本選擇上可有：組織、惡性胸水及血液，臨床中多因組織獲取困難，更多選擇液體活檢，NCCN等多項指南已經推薦使用NGS進行液體檢測。Oxnard等研究指出，一代TKI治療后失敗的NSCLC患者若檢測出T790M突變陽性患者的進展后生存期顯著長于無T790M突變患者。因此，T790M突變既是EGFR-TKI耐藥的原因之一，也因為其可選擇三代TKI進行后續治療而因此成為進展后生存的良好預后因子。動態檢測T790M突變可能預測未來的耐藥，可以進一步探究T790M突變誘導的耐藥機制，并指導進展期NSCLC患者的治療，但其中細則問題需要更多研究來論證，為使NSCLC治療更個體化、更精準化，也需要血液T790M突變檢出率靈敏度、特異性的提高。