[發(fā)明專利]一種檢測(cè)EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒及其檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811269530.0
• 申請(qǐng)日: 2018-10-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109385476A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 包文靜;金安娜;龔偉;高伙妮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海睿璟生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明涉及基因突變檢測(cè)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種檢測(cè)EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒，包括核酸擴(kuò)增試劑和對(duì)照品，所述核酸擴(kuò)增試劑包括EGFR T790M反應(yīng)液，所述反應(yīng)液中含有用于檢測(cè)EGFR基因T790M突變的特異性引物和熒光探針，所述反應(yīng)液中還包含一對(duì)上游引物和下游引物以及MGB熒光探針；所述核酸擴(kuò)增試劑還包括2×QuantStudio 3D Digital PCR Mix。本發(fā)明還公開(kāi)了上述檢測(cè)EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒的檢測(cè)方法的檢測(cè)方法。本申請(qǐng)的試劑盒采用數(shù)字PCR技術(shù)，可對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者組織或血漿DNA樣本中的T790M突變進(jìn)行定量檢測(cè)，從而輔助患者的靶向用藥治療方案的制定。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因突變檢測(cè)領(lǐng)域，具體是一種檢測(cè)EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

肺癌一直以來(lái)位居全球癌癥相關(guān)死亡首位。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2014年全美新發(fā)肺癌224210例，位居癌癥第二位，其中非小細(xì)胞肺癌占80％。盡管化療取得了一些進(jìn)步，但目前以鉑類為基礎(chǔ)的最有效化療方案的中位生存時(shí)間也不會(huì)超過(guò)10個(gè)月。近年來(lái)，EGFR絡(luò)氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)的廣泛應(yīng)用使非小小細(xì)胞肺癌的治療獲得很大進(jìn)步。目前第一代EGFR絡(luò)氨酸激酶抑制劑吉非替尼和厄洛替尼廣泛應(yīng)用于NSCLC的治療。它們可逆地與ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而阻止了EGFR下游通路的激活。

雖然在EGFR-TKI使用之初效果顯著，但是多數(shù)患者最終都會(huì)在使用后9-10個(gè)月發(fā)生耐藥或病情進(jìn)展。在2005年對(duì)于EGFR-TKI耐藥患者的病例分析中首次提到了T790M突變。耐藥后標(biāo)本的20外顯子上密碼子790中的C到T堿基的突變使得相應(yīng)蘇氨酸(T)被甲硫氨酸(M)取代，此關(guān)鍵位置的氨基酸的改變使得已有的L858R突變的激酶結(jié)構(gòu)域?qū)TP親和力反超EGFR-TKI，使EGFR-TKI在和ATP的競(jìng)爭(zhēng)中處于弱勢(shì)而無(wú)法繼續(xù)阻斷EGFR的信號(hào)通路，即表現(xiàn)為耐藥或疾病進(jìn)展。

最近幾年，針對(duì)該突變的以?shī)W希替尼為代表的第三代TKI進(jìn)入大家的視線，由于其臨床療效及可耐受的毒副作用，F(xiàn)DA加速審批，批準(zhǔn)其可作為一代TKI耐藥后的治療策略。奧希替尼一種不可逆的三代EGFR-TKI，可以選擇性地抑制EGFR敏感突變和T790M突變。2017年3月，奧希替尼在華上市，開(kāi)創(chuàng)了EGFR-TKI耐藥后T790M陽(yáng)性患者的精準(zhǔn)治療新時(shí)代。隨著該藥物的上市，如何敏感、準(zhǔn)確地檢測(cè)T790M突變成為臨床關(guān)注的熱點(diǎn)。

《2016年的晚期原發(fā)性肺癌診治專家共識(shí)》建議有條件的患者在疾病進(jìn)展時(shí)應(yīng)再次進(jìn)行腫瘤組織活檢，并進(jìn)行病理和相關(guān)的基因檢測(cè)以明確耐藥的性質(zhì)。目前，T790M檢測(cè)方法主要包括：①擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)法(amplified refractory mutation system，ARMS)；②聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)；③二代測(cè)序法(next-generationsequencing，NGS)。ARMS法只能檢測(cè)已知突變，方便快捷、特異度高，在臨床廣泛應(yīng)用；而NGS是近年發(fā)展起來(lái)的高通量深度測(cè)序技術(shù)群，可一次性對(duì)幾百萬(wàn)條至十億條DNA分子進(jìn)行并行測(cè)序，但對(duì)稀有突變及結(jié)構(gòu)變異不敏感且價(jià)格昂貴，廣泛應(yīng)用仍受到限制。在標(biāo)本選擇上可有：組織、惡性胸水及血液，臨床中多因組織獲取困難，更多選擇液體活檢，NCCN等多項(xiàng)指南已經(jīng)推薦使用NGS進(jìn)行液體檢測(cè)。Oxnard等研究指出，一代TKI治療后失敗的NSCLC患者若檢測(cè)出T790M突變陽(yáng)性患者的進(jìn)展后生存期顯著長(zhǎng)于無(wú)T790M突變患者。因此，T790M突變既是EGFR-TKI耐藥的原因之一，也因?yàn)槠淇蛇x擇三代TKI進(jìn)行后續(xù)治療而因此成為進(jìn)展后生存的良好預(yù)后因子。動(dòng)態(tài)檢測(cè)T790M突變可能預(yù)測(cè)未來(lái)的耐藥，可以進(jìn)一步探究T790M突變誘導(dǎo)的耐藥機(jī)制，并指導(dǎo)進(jìn)展期NSCLC患者的治療，但其中細(xì)則問(wèn)題需要更多研究來(lái)論證，為使NSCLC治療更個(gè)體化、更精準(zhǔn)化，也需要血液T790M突變檢出率靈敏度、特異性的提高。