[發明專利]一種檢測EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201811269530.0
• 申請日: 2018-10-29
• 公開（公告）號: CN109385476A
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發明（設計）人: 包文靜;金安娜;龔偉;高伙妮
• 申請（專利權）人: 上海睿璟生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒，其特征在于，包括核酸擴增試劑和對照品，所述核酸擴增試劑包括反應液，所述反應液中含有用于檢測EGFR基因T790M突變的特異性引物和熒光探針，所述特異性引物還包含一對上游引物和下游引物，所述熒光探針為MGB熒光探針，所述MGB熒光探針還包括野生型探針和突變型探針；所述特異性引物和熒光探針的序列與修飾如下：

上游引物 5’-ACGTGTGCCGCCTGCT-3’

下游引物 5’-TTGTGTTCCCGGACAT-3’

野生型探針 5’-FAM-TCATCACGCAGCTC-MGB-3’

突變型探針 5’-FAM-TCATCATGCAGCTC-MGB-3’；

所述核酸擴增試劑還包括2×QuantStudio 3D Digital PCR Mix。

2.根據權利要求1所述的檢測EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒，其特征在于，所述反應液中包含的特異性引物含量為900nmol/L，熒光探針含量為250nmol/L。

3.根據權利要求1所述的檢測EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒，其特征在于，所述QuantStudio 3D Digital PCR Mix為2×工作液，配制時加入量為總體系量的一半。

4.根據權利要求1-3任一所述的檢測EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒，其特征在于，所述對照品還包括陽性對照和陰性對照。

5.根據權利要求4所述的檢測EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為工藝用水，所述陽性對照為突變質粒和野生型質粒混合物。

6.根據權利要求5所述的檢測EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒，其特征在于，所述突變質粒所包含的EGFR基因片段序列如下：

GCCCCTCCTTCTGGCCACCATGCGAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGTAATCAGGGAAGGGAGATACGGGGAGGGGAGATAAGGAGCCAGGATCCTCACATGC。

7.基于如權利要求1-6任一所述的檢測EGFR基因T790M突變的PCR試劑盒的檢測方法，其特征在于，包含步驟如下：

(1)根據不同樣本類型選擇相應商業DNA提取試劑盒進行DNA的提取，作為檢測的模板；

(2)配制EGFR T790M檢測3D數字PCR反應體系，體系包含：

(3)使用芯片上樣儀，將上述反應體系取14.5μL均勻分布到PCR芯片上；

(4)將芯片放置到PCR儀上進行擴增，擴增程序為：

(5)擴增完成，取出芯片；將芯片放置到芯片讀取儀內進行掃描；

(6)掃描結束，將數據上傳至服務器，劃定閾值完成結果的分析。