[發(fā)明專利]一種引物探針組合物及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811269364.4
• 申請(qǐng)日: 2018-10-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109321569B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程雪濤;吳子俠;金麗琴;張亞飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 邁杰轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究（蘇州）有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明提供了一種引物探針組合物及其應(yīng)用，所述組合物包括四條探針及十二條引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1?12所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.13?16所示；本發(fā)明針對(duì)雄激素受體V7的目的區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，以引物探針組合物為基礎(chǔ)，摸索實(shí)驗(yàn)條件，優(yōu)化檢測(cè)體系，二者相輔相成，實(shí)現(xiàn)高靈敏度和強(qiáng)特異性的檢測(cè)，特異性地定量檢測(cè)人類AR?V7表達(dá)量，檢測(cè)樣品范圍廣，檢測(cè)靈敏度高，操作方便，簡(jiǎn)潔高效，具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的市場(chǎng)價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種引物探針組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

前列腺癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，雄激素受體(AR)在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，其通過(guò)調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。手術(shù)治療仍然是早期前列腺癌的一線治療方案，晚期前列腺癌的治療方法主要是內(nèi)分泌治療，即雄激素剝奪治療(ADT)。美國(guó)FDA已經(jīng)批準(zhǔn)包括CYP17A1抑制劑阿比特龍和強(qiáng)效抗雄激素藥物恩雜魯胺作為治療轉(zhuǎn)移性前列腺癌的二線治療方案。但在前列腺癌的治療過(guò)程中，常常對(duì)其產(chǎn)生耐藥，并發(fā)展成為去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC)?；颊呓?jīng)阿比特龍和恩雜魯胺治療，AR-V7陽(yáng)性患者與陰性患者相比，臨床或影像學(xué)無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間和總體生存時(shí)間都明顯縮短。

AR基因位于X染色體q11-12，包含由8個(gè)外顯子組成的一個(gè)2757bp的閱讀框架，分子質(zhì)量約110kb。全長(zhǎng)的AR(AR-FL)包含四個(gè)結(jié)構(gòu)：(1)氨基端結(jié)構(gòu)域(amino-terminaldomain，NTD)，由exon 1編碼，包含555個(gè)氨基酸，占了AR蛋白總長(zhǎng)度的60％左右；(2)DNA結(jié)合域(DNA binding domain，DBD)，由exon 2和3編碼，包含68個(gè)氨基酸；(3)鉸鏈區(qū)(Hingedomain，HD)，連接DBD和LBD；(4)配體結(jié)合域(Ligand binding domain，LBD)，由exon 4-8編碼，包含295個(gè)氨基酸。AR-Vs的產(chǎn)生是通過(guò)AR基因重組、AR前mRNA剪接或基因突變等機(jī)制，AR-V7(又稱AR3)是最常見(jiàn)的AR-Vs。AR-V7具有完整的NTD結(jié)構(gòu)域和DBD結(jié)構(gòu)域，但缺乏LBD結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)，代之而起的是神秘外顯子3(CE3)編碼的一段短肽序列。而LBD結(jié)合域是恩雜魯胺所針對(duì)的靶點(diǎn)，從而導(dǎo)致患者產(chǎn)生耐藥。因此，AR-V7參與了恩雜魯胺和阿比特龍耐藥性的發(fā)展。

根據(jù)最新的研究資料表明(Anna Katharina Seitz et al.AR-V7in PeripheralWhole Blood of Patients with Castration-resistant Prostate Cancer：Associationwith Treatment-specific Outcome Under Abiraterone and Enzalutamide，EuropeanUrology,2017.)，基于數(shù)字PCR平臺(tái)檢驗(yàn)了85例用阿比特龍或恩雜魯胺治療的患者及28例健康人做對(duì)照，以確定AR-V7表達(dá)量的背景值。研究發(fā)現(xiàn)在健康人中AR-V7最高的表達(dá)量為0.6％，以此將AR-V7的表達(dá)量劃分為高表達(dá)組(AR-V7/AR-FL0.6％)與低表達(dá)組(AR-V7/AR-FL≤0.6％)。在85例用阿比特龍或恩雜魯胺治療的患者中高AR-V7表達(dá)水平達(dá)到18％，且無(wú)PSA應(yīng)答，而仍有部分低AR-V7表達(dá)的患者有PSA應(yīng)答。高AR-V7表達(dá)水平的患者無(wú)進(jìn)展生存期更短(median 2.4vs 3.7months；p0.001)，總生存期也更短(median4.0vs.13.9months；p0.001)。有此可得出，AR-V7的表達(dá)量差異會(huì)導(dǎo)致CPRC患者的PSA應(yīng)答(耐藥性)以及生存期的差異，因此，準(zhǔn)確檢測(cè)AR-V7的表達(dá)量是十分必要的。CN108070641A公開(kāi)了一套基于qPCR或數(shù)字PCR技術(shù)開(kāi)發(fā)的用于檢測(cè)囊泡中AR-V7及AR的引物及探針，序列分別如SEQ ID NO:1-6所示，利用所述引物及探針建立了一種基于囊泡的無(wú)創(chuàng)、快速、高靈敏度的AR-V7及全長(zhǎng)AR的qPCR或數(shù)字PCR檢測(cè)方法。該體系及其數(shù)字PCR方法采用單熒光檢測(cè)，只能計(jì)算拷貝數(shù)，不能直接反映AR-V7在mRNA水平上的表達(dá)百分比。