[發(fā)明專利]一種定量檢測堿性磷酸酶活性的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811268416.6
• 申請日: 2018-10-29
• 公開（公告）號: CN109270041B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 逯一中;倪朋娟;陳傳霞;姜媛媛
• 申請（專利權(quán)）人: 濟(jì)南大學(xué)
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 上海科律專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 31290
• 代理人: 金碎平

本發(fā)明提供了一種定量檢測堿性磷酸酶的方法，其包括如下步驟：制備碳量子點；將二乙醇胺緩沖液、氯化鎂溶液、抗壞血酸?2?磷酸三鈉鹽、碳量子點和去離子水混勻，得到測試液；將所述測試液均為若干份，除一份不加堿性磷酸酶作為對照樣外，其余各份中分別加入不同已知濃度的堿性磷酸酶，混勻后，均在37℃下進(jìn)行孵育；孵育結(jié)束后，分別進(jìn)行熒光光譜測試，得到堿性磷酸酶的活性和熒光強(qiáng)度關(guān)系式。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：1、采用碳量子點作為熒光探針，具有制備方法簡單、成本低、綠色環(huán)保等優(yōu)勢；此外，該碳量子點無需復(fù)雜的修飾或使用濃酸處理；2、ALP檢測方法較為簡單，只需將C?dots，ALP，2?AAP，緩沖溶液混合孵育即可測定。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種定量檢測堿性磷酸酶活性的方法，屬于酶檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

堿性磷酸酶(簡稱ALP)廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)，它具有催化磷酸酯水解的能力。此外，ALP通常被用作臨床診斷的重要生物標(biāo)志物，因為其含量異常與許多疾病如骨病，糖尿病，前列腺癌和肝功能障礙密切相關(guān)。因此，開展高靈敏及高選擇性的ALP檢測方法的研究具有重要意義。常用于ALP檢測的方法有熒光光譜法、比色法、電化學(xué)法及化學(xué)發(fā)光法等。其中，熒光光譜法因其具有靈敏度高、操作簡單和響應(yīng)快等優(yōu)勢，引起人們廣泛關(guān)注。熒光光譜法檢測ALP大多基于有機(jī)熒光探針、半導(dǎo)體量子點、熒光共聚物和貴金屬納米簇等作為熒光探針。但是有機(jī)熒光探針?biāo)苄暂^差，半導(dǎo)體量子點毒性較大，熒光共聚物制備步驟復(fù)雜且費(fèi)時，貴金屬納米簇成本較高且穩(wěn)定性差。因此，發(fā)展新型熒光探針用于ALP檢測具有重要的意義。

C-dots具有水溶性好、合成方法簡單、成本低及穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，在ALP熒光光譜檢測表現(xiàn)出巨大的潛力。有研究利用C-dots-Cu²⁺-PPi體系成功實現(xiàn)了ALP的熒光光譜法檢測；但所用的碳量子點的制備需要利用濃酸處理方法，較為危險。有研究發(fā)展了一種C-dots-MnO₂納米片檢測ALP的方法。但該方法中所用的MnO₂納米片制備方法較為復(fù)雜和費(fèi)時，限制了它在實際檢測中的應(yīng)用。還有研究利用β-環(huán)糊精修飾的C-dots檢測ALP，C-dots的表面修飾方法較為復(fù)雜。因此，需要發(fā)展簡單及環(huán)境友好的方法用于C-dots的制備，并將制備的C-dots無須額外修飾或利用其它材料直接用于ALP的檢測。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測堿性磷酸酶活性的方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種定量檢測堿性磷酸酶活性的方法，其包括如下步驟：

制備碳量子點；

將二乙醇胺緩沖液、氯化鎂溶液、抗壞血酸-2-磷酸三鈉鹽、碳量子點和去離子水混勻，得到測試液；

將所述測試液均為若干份，除一份不加堿性磷酸酶作為對照樣外，其余各份中分別加入不同已知濃度的堿性磷酸酶，混勻后，均在37℃下進(jìn)行孵育；

孵育結(jié)束后，分別進(jìn)行熒光光譜測試，得到堿性磷酸酶的活性和熒光強(qiáng)度關(guān)系式，如式I所示：

(F₀-F)/F₀＝0.004+0.070c I；

式中：c為堿性磷酸酶的活性，單位是mU mL^-1，F(xiàn)₀為空白樣的熒光強(qiáng)度值，F(xiàn)為測試樣的熒光強(qiáng)度值，線性相關(guān)系數(shù)為0.994。

作為優(yōu)選方案，所述碳量子點的制備方法為：

將3-氨基苯硼酸溶于超純水中，加入氫氧化鈉溶液，在180℃下進(jìn)行水熱反應(yīng)后，得到碳量子點溶液。

作為優(yōu)選方案，所述孵育時間為30～200min。