[發明專利]一種單分子蛋白的檢測方法

有效

• 申請號: 201811268075.2
• 申請日: 2018-10-29
• 公開（公告）號: CN109142756B
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發明（設計）人: 夏江;宋小慧;位玉玲
• 申請（專利權）人: 領航基因科技（杭州）有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 劉偉;趙青朵

本發明屬于蛋白檢測領域，公開了一種單分子蛋白的檢測方法，待測蛋白與靶蛋白抗體混合生成待測蛋白與靶蛋白抗體復合物，與經標記物標記的檢測抗體混合解離收集待測蛋白和檢測抗體的復合物；所述標記物為熒光素標記物或酶標記物；將所述待測蛋白和檢測抗體的復合物直接分散于微流控芯片或先將所述待測蛋白和檢測抗體的復合物與酶標記物對應的底物混合反應然后將反應液分散于微流控芯片中；利用激光共聚焦檢測系統進行熒光信號掃描，單分子計數。本發明所述檢測方法可以快速對單分子蛋白進行定量檢測，檢測靈敏度高，適用于對表達豐度過低的蛋白。本發明所述檢測方法操作方便，檢測結果準確、CV值偏差小；而且通量高，可一次性檢測多個樣本。

技術領域

本發明屬于蛋白檢測領域，具體涉及一種單分子蛋白的檢測方法。

背景技術

蛋白，作為機體最重要的組成成分，詮釋著生命個體每一點的生長，發育和變化。從上世紀40年代開始，隨著免疫組化等經典蛋白檢測技術的發展，蛋白作為生物標志物的價值逐漸被人們所重視。盡管免疫組化，ELISA， Luminex等蛋白檢測技術已經實現了數以千計的蛋白生物標志物檢測，但蛋白生物標志物的開發速度仍顯緩慢：年均僅有1-2個新的生物標志物進入實際的臨床應用。據統計，在400,000多種已知的人類蛋白中，約有300,000種因為表達豐度過低而無法實現傳統方法的檢測。在現有技術可以檢測的約100,000種蛋白中，大多數又無法在健康個體的樣本中檢測到，而僅僅出現在特定的疾病時期。大量蛋白生物標志物的重要功能，如同海平面下的冰山，無法被現有技術準確界定。不論臨床還是基礎研究，蛋白生物標志物的應用都擁有可觀的發展前景，但現有技術的瓶頸極大限制了蛋白生物標志物的發展。

默克公司推出了單分子檢測技術驅動的免疫檢測平臺，采用激光檢測對每個單分子二抗上標記的熒光信號進行計數。其中的單分子檢測技術(SingleMoleculeCounting,SMC^TM)能降低背景，并提高檢測信號，MC^TM技術相較于傳統免疫檢測技術，信噪比有了很顯著的改善，使得在一個系統里可以同時檢測低表達和高表達的蛋白靶標，揭示疾病相關生物標志物的微小變化。SMC^TM技術的工作流程，在捕獲和檢測步驟，特異性抗體將每個生物標志物分子轉化成信號。在洗脫步驟，熒光素標記的檢測抗體從免疫復合物中解離下來。洗脫物被送入系統的毛細管，毛細管上有一個非常微小的檢測空間可供激光照射。通過檢測空間時，單個的熒光素標記抗體可以產生熒光閃爍，從而被檢測到。峰高超過閾值的熒光信號會被統計為數字信號事件。由于激光的聚焦效應，會形成一個非常狹小的檢測空間“愛里斑”，這個空間集中了多達84％的激光能量，能夠最有效地照射和激發單個熒光分子。 SMC^TM單分子檢測技術會依次檢測通過“愛里斑”區域的單個熒光信號，峰高超過閾值的熒光信號會被統計為數字信號，并將檢測到的數字信號進行匯總，顯著地提高了檢測靈敏度，可達pg/ml。但仍無法滿足對表達豐度過低的蛋白進行檢測的要求。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于針對現有技術中存在的檢測靈敏度低，無法滿足對表達豐度過低的蛋白進行檢測的要求的問題，提供一種單分子蛋白的檢測方法。

為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：

一種單分子蛋白的檢測方法，包括以下步驟：

(1)待測蛋白與靶蛋白抗體混合，生成待測蛋白與靶蛋白抗體復合物；

(2)將待測蛋白與靶蛋白抗體復合物與經標記物標記的檢測抗體混合，解離收集待測蛋白和檢測抗體的復合物；所述標記物為熒光素標記物或酶標記物；

(3)當標記物為熒光素標記物時，將所述待測蛋白和檢測抗體的復合物直接分散于微流控芯片；當標記物為酶標記物時，先將所述待測蛋白和檢測抗體的復合物與酶標記物對應的底物混合反應，然后將反應液分散于微流控芯片中；

(4)利用激光共聚焦檢測系統對所述微流控芯片內部的液滴進行熒光信號掃描，單分子計數。