[發明專利]一種單分子蛋白的檢測方法

有效

• 申請號: 201811268075.2
• 申請日: 2018-10-29
• 公開（公告）號: CN109142756B
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發明（設計）人: 夏江;宋小慧;位玉玲
• 申請（專利權）人: 領航基因科技（杭州）有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 劉偉;趙青朵

1.一種單分子蛋白的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)待測蛋白與靶蛋白抗體混合，生成待測蛋白與靶蛋白抗體復合物；

(2)將待測蛋白與靶蛋白抗體復合物與經標記物標記的檢測抗體混合，解離收集待測蛋白和檢測抗體的復合物；所述標記物為熒光素標記物或酶標記物；

(3)當標記物為熒光素標記物時，將所述待測蛋白和檢測抗體的復合物直接分散于微流控芯片；當標記物為酶標記物時，先將所述待測蛋白和檢測抗體的復合物與酶標記物對應的底物混合反應，然后將反應液分散于微流控芯片中；

(4)利用激光共聚焦檢測系統對所述微流控芯片內部的液滴進行熒光信號掃描，單分子計數。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述熒光素標記物為異硫氰酸熒光素、AMCA、Texas Red、TRITC、Rhodamine、R-PE、Cy3/5、DylightDyes或APC。

3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述酶標記物為β-半乳糖苷酶，所述酶標記物對應的底物為二半乳糖苷；或所述酶標記物為辣根過氧化物酶，所述酶標記物對應的底物為魯米諾。

4.根據權利要求1～3任一項中所述的檢測方法，其特征在于，所述靶蛋白抗體偶聯在磁珠上，加入標記物標記的檢測抗體溶液混合孵育后去除磁珠；所述磁珠為納米級Fe、Ni、Fe₃O₄或Fe₂O₃磁性微粒，磁珠粒徑500nm-10μ m 。

5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)中，當標記物為熒光素標記物時，將靶蛋白與熒光素標記物標記的檢測抗體復合物溶液作為水相，于鋪滿油相的微流控芯片中進行液滴生成；當標記物為酶標記物時，靶蛋白與酶標記物標記的檢測抗體復合物溶液與酶標記物的底物混合作為水相，于鋪滿油相的微流控芯片中進行液滴生成。

6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述的液滴生成方法具體為將油相充滿微流控芯片整個液滴存儲腔；將水相通過壓力泵從微流控芯片液滴形成通道輸入芯片，水相在所述微流控芯片中的臺階結構處形成舌狀流體，并在剪切力的作用下形成油包水微滴落入液滴存儲部件內，液滴在液滴存儲腔中聚集濃縮，以多層狀態鋪滿腔體。

7.根據權利要求5或6所述的檢測方法，其特征在于，所述油相包括主體成分和表面活性劑，所述主體成分包括礦物油和烷烴，所述烷烴為12～16烷中的一種或其兩者以上的混合物；所述表面活性劑包括EM90和Triton X-100。

8.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述微流控芯片包括上片、基片(6)、進樣孔(4)和進樣腔(10)；

所述上片設置有液滴形成流道(1)和液滴存儲部件(2)；

所述液滴形成流道(1)與所述液滴存儲部件(2)之間通過臺階結構(12)連接；

所述基片(6)與所述液滴存儲部件(2)之間設置有液滴存儲腔(8)；

所述基片(6)設置有凹槽(7)，所述凹槽(7)與所述液滴存儲部件(2)緊密配合，形成液滴存儲腔(8)；

所述進樣孔(4)、所述進樣腔(10)、所述液滴形成流道(1)、所述臺階結構(12)與所述液滴存儲部件(2)依次連接。

9.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，還包括進樣部件(9)、排油流道(3)、排油腔(11)和排油孔(5)；

所述進樣部件(9)包括進油端口(9.1)和儲油端口(9.2)；

所述進油端口(9.1)、所述液滴存儲部件(2)、所述排油流道(3)、所述排油腔(11)、所述排油孔(5)與所述儲油端口(9.2)依次連接；

所述進樣孔(4)、所述進樣腔(10)設置于所述液滴存儲部件(2)的一側，所述排油腔(11)設置于所述液滴存儲部件(2)的其余側邊的外周，所述排油孔(5)設置于所述液滴存儲部件(2)的另一側。