[發明專利]識別PCV2病毒樣顆粒的單克隆抗體及其在定性及定量檢測PCV2病毒樣顆粒中的應用

有效

• 申請號: 201811261025.1
• 申請日: 2018-10-26
• 公開（公告）號: CN109536456B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 蔡雪輝;孫明霞;涂亞斌;王淑杰
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心哈爾濱分中心）;哈爾濱維科生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/08;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

1.一株能夠穩定分泌特異性識別豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）病毒樣顆粒（virus-like particles, VLPs）單克隆抗體的雜交瘤細胞株，所述的雜交瘤細胞株命名為3H9，保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC NO.15793，保藏時間為2018年6月6日。

2.由權利要求1所述的雜交瘤細胞株分泌產生的能夠特異性識別豬圓環病毒2型病毒樣顆粒的單克隆抗體。

3.權利要求2所述的所述的單克隆抗體在檢測豬圓環病毒2型病毒樣顆粒中的用途。

4.一種用于定性及定量檢測PCV2病毒樣顆粒的雙夾心ELISA檢測試劑盒，其特征在于，含有權利要求2所述的單克隆抗體、兔抗PCV2 VLPs多克隆抗體以及HRP標記的羊抗兔多克隆抗體。

5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括酶標板、包被液、封閉液、稀釋液、顯色液、洗滌液、終止液、HRP偶聯物穩定/稀釋劑以及PCV2 VLPs標準品。

6.如權利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，用于豬圓環病毒2型病毒樣顆粒檢測時，按照以下步驟進行：

（1）權利要求2所述的單克隆抗體用包被液按照1:12800稀釋，每孔100微升加入到ELISA板，4℃包被過夜；

（2）對包被好的ELISA板用洗滌液洗滌4次，每孔200微升，每次5分鐘；加入200微升/孔封閉液到ELISA板，37℃封閉2小時；

（3）用PBS調整PCV2 VLPs標準品濃度為600μg/ml，2倍比稀釋后得到梯度的PCV2 VLPs標準品；

（4）取各稀釋度的PCV2 VLPs標準品和待檢測樣品各100微升，分別加入封閉好的ELISA板，37℃孵育1小時；

（5）孵育完畢后ELISA板用PBST溶液洗滌4次，每孔200微升，每次5分鐘；

（6）兔抗PCV2 VLPs多克隆抗體按照1:3200稀釋，每孔100微升加入ELISA板，37℃孵育1小時；

（7）用PBST溶液洗滌4次，每孔200微升，每次5分鐘；HRP標記的羊抗兔多克隆抗體用HRP偶聯物穩定/稀釋劑按照1:10000稀釋，每孔100微升加入ELISA板，37℃孵育1小時；

（8）抗體孵育完畢后ELISA板用洗滌液洗滌4次，每次5分鐘；

（9）每孔加入顯色液100微升，37℃反應10分鐘，每孔加入50微升2M硫酸終止反應；

（10）將酶標儀設定檢測波長為450nm，在10分鐘內對ELISA板進行讀數，測定吸光值；將標準品濃度對數值為橫坐標（X軸），相應OD值為縱坐標（Y軸），繪制標準曲線圖，將待測樣品的吸光值代入方程，計算蛋白質含量。

7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的包被液為50mM的碳酸鹽包被緩沖液，pH9.6；所述的封閉液為含10g/L BSA的0.01M PBS溶液，pH 7.6；所述的稀釋液為0.02MPBS緩沖液，pH7.0；所述的洗滌液為含有體積百分比濃度為0.5%Tween20的0.1mol/L PBS溶液，pH 7.6，使用時稀釋10倍；所述的顯色液為TMB顯色液；所述的終止液為2M硫酸。

8.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，標準曲線圖的R2值應不低于0.9800。