[發明專利]識別PCV2病毒樣顆粒的單克隆抗體及其在定性及定量檢測PCV2病毒樣顆粒中的應用

有效

• 申請號: 201811261025.1
• 申請日: 2018-10-26
• 公開（公告）號: CN109536456B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發明（設計）人: 蔡雪輝;孫明霞;涂亞斌;王淑杰
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心哈爾濱分中心）;哈爾濱維科生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/08;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

本發明公開了一種識別PCV2病毒樣顆粒的單克隆抗體及其在定性及定量檢測PCV2病毒樣顆粒中的應用。其中，能夠特異性識別豬圓環病毒2型病毒樣顆粒的單克隆抗體由保藏編號為CGMCC NO.15793的雜交瘤細胞株分泌產生。通過間接免疫熒光實驗鑒定所得到的單克隆抗體3H9的特異性，結果表明該單克隆抗體可以特異性識別PCV2病毒粒子，并且能夠與PCV2 VLPs反應，而不與線性cap蛋白包被的ELISA板反應。因此，本發明建立了一種可以同時定性和定量分析PCV2 VLPs的簡便方法，解決了PCV2 VLP粒子結構檢測儀器昂貴，操作困難以及定量方法不能區分非特異性蛋白和破碎亞基的問題。

技術領域

本發明涉及一株識別PCV2病毒樣顆粒的單克隆抗體以及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞，還涉及該單克隆抗體在定性及定量檢測PCV2病毒樣顆粒(virus-likeparticles,VLPs)中的應用。本發明屬于生物醫藥技術領域。

背景技術

在疫苗研發，生產的各個環節，如菌種鑒定培養、分離純化、產品檢測等各個環節均需要對疫苗有效成分進行定性和定量分析檢測。在菌種培養發酵，蛋白純化，疫苗配制過程對疫苗有效成分VLPs進行定量檢測分析，快速準確地對疫苗進行分析表征，對于建立和優化分離純化工藝，提高產品質量、降低生產成本，以及確保疫苗安全有效都具有重要的意義。與其他生物分子相比，VLP疫苗往往分子量更大 (分子量高達數百萬甚至數千萬)、結構更加復雜(多個亞基組裝)、穩定性差，因此，選擇合適的分析方法顯得尤其重要，建立準確可靠的分析方法的難度也更大。

目前，對VLPs進行定性分析，鑒定VLPs結構及組裝的完整性和正確性有多種方法，但是均需要特殊的儀器完成，在生產過程中操作比較困難。主要方法有如下幾種：

圓二色光譜(CD)是應用最為廣泛的測定蛋白質二級結構的方法和主要研究手段之一，是研究蛋白質構象的一種比較快速、簡單、較準確的方法。它可以在接近其生理狀態的溶液狀態下測定，對構象變化靈敏，已廣泛應用于蛋白質的構象研究中。蛋白形成聚集體VLPs之后，構象通常會發生變化，其α-螺旋的比例下降，β- 折疊的比例增加。因此，在VLP疫苗的研究中，CD主要用于疫苗的二級結構分析、疫苗樣品和標準品等的比對以及疫苗結構變化的表征分析。

透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope,TEM)技術作為快速檢測病毒的常用手段之一，在病毒檢測中發揮著異常重要的作用。TEM的分辨率最小可以達到0.1nm，可以看到在光學顯微鏡下無法看清的亞顯微結構或超微結構，它是迄今為止能夠直接觀察病毒和VLP疫苗顆粒具體形態的主要方法。

冷凍電鏡及X光晶體衍射可以得到高分辨率的病毒粒子或VLP結構，分辨率遠敢于透射電鏡，是一種更精細的直接觀察病毒和VLP顆粒具體形態的方法。

超速離心技術是VLP疫苗的檢測中不可或缺的一種方法，主要包括差速離心法和密度梯度離心法。同時，超速離心也是一種小規模純化VLP疫苗的有效方法，可以濃縮和純化VLP疫苗，供后續分析和其它性能表征。分析型的超速離心技術還可以直接測定VLP疫苗的浮力密度和和沉降系數。

高效液相體積排阻色譜(High Performance Liquid Size ExclusionChromatography, HPSEC)主要用于VLP疫苗分子量、純度和含量的測定。HPSEC通過標準VLP疫苗樣品在分析柱上的保留體積，可以大致判斷純化樣品的分子量。一般VLP疫苗的分子量與其亞基的分子量相差較大，通過HPSEC很容易的將完整的VLP與亞基分開，進而可以對純化樣品中疫苗顆粒的完整性進行快速的檢測。同時HPSEC靈敏度高，能夠達到微克級的檢測，用不同濃度的標準樣品建立濃度-峰面積(或峰高) 的標準曲線，可以實現對微量疫苗樣品的快速、準確定量。