[發明專利]一種免疫原性增強型小反芻獸疫N蛋白基因重組腺病毒的制備方法

在審

• 申請號: 201811258858.2
• 申請日: 2018-10-26
• 公開（公告）號: CN109295013A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 陳靜;王苗利;田夫林;張鶴曉;李佳璇;孫圣福;馬慧玲;張月;孔祥華;藺曉月
• 申請（專利權）人: 山東省動物疫病預防與控制中心
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/861;C12N15/45;C12N15/66;A61K39/155;A61P31/14
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 楊海明

本發明公開了一種免疫原性增強型小反芻獸疫N蛋白基因重組腺病毒的制備方法，將小反芻獸疫N蛋白基因和Ag85A基因重組到復制缺陷性腺病毒上，以提高N蛋白刺激機體產生抗體的能力。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種免疫原性增強型小反芻獸疫N蛋白基因重組腺病毒的制備方法。

背景技術

小反芻獸疫（pestedespetitsruminants,PPR）是由副粘病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒引起的一種高度接觸性傳染病，俗稱“羊瘟”。本病主要發生于山羊、綿羊及野生小反芻動物，發病率和病死率均較高，世界動物衛生組織（OIE）將其列為必須報告的動物疫病，中國列為一類動物疫病。1942年該病首次發現于非洲的科特迪瓦，隨后的幾年時間PPR幾乎傳遍了赤道到撒哈拉沙漠的所有非洲國家。隨著該病的不斷蔓延，中國周邊國家（老撾、孟加拉國、俄羅斯、印度、巴基斯坦、塔吉克斯坦、哈薩克斯坦、蒙古國、緬甸、尼泊爾、阿富汗和韓國）頻頻大規模暴發PPR疫情。2007年，西藏阿里地區首次暴發了本病，此后逐漸在我國蔓延開來。

目前，PPR防控主要以弱毒疫苗免疫為主。1989年，Diallo等將PPRVNigeria75/1株接種于Vero細胞上，連續傳代，成功地將Nigeria75/1致弱，研制出第一株PPRV的同源弱毒疫苗，該疫苗目前仍在非洲地區廣泛使用。我國發生小反芻獸疫疫情后，很快生產出小反芻獸疫弱毒活疫苗（75/1株），用于緊急接種和日常接種。弱毒苗的使用，使疫情得到有效控制。由于弱毒苗是細胞傳代致弱的，存在毒力反強的可能性，因此探索安全有效的新型疫苗對防控工作來說是必須的。

發明內容

本發明的目的是提供一種免疫原性增強型小反芻獸疫N蛋白基因重組腺病毒的制備方法，將小反芻獸疫N蛋白基因和Ag85A基因重組到復制缺陷性腺病毒上，以期提高N蛋白刺激機體產生抗體的能力。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種免疫原性增強型小反芻獸疫N蛋白基因重組腺病毒的制備方法，包括如下步驟：

S1，將腦心肌炎病毒的核糖體結合位點序列IRES連接到復制缺陷型腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA上,然后提取重組腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA-

IRES；

S2，將含有小反芻獸疫N蛋白的DNA序列和含有結核分枝桿菌Ag85A基因的DNA序列克隆至重組腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA-IRES上，而后提取重組腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA-N-IRES-Ag85A；

S3，將提取得到的重組腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA-N-IRES-Ag85A和復制缺陷型腺病毒pacAd59.2-100骨架DNA經線性化后，轉染真核細胞AD-293，得到重組腺病毒rAd-N-IRES-Ag85A；

S4，將所得到的重組腺病毒rAd-N-IRES-Ag85A經濃縮、純化、擴增，制備得免疫原性增強型小反芻獸疫N蛋白基因重組腺病毒。

進一步的，所述步驟S2中，小反芻獸疫N蛋白的DNA序列和含有結核分枝桿菌Ag85A基因的DNA序列以共表達的形式克隆至重組腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA-IRES上。

進一步的，所述步驟S2中，轉染真核細胞AD-293的過程是在脂質體的作用下共同完成的。

進一步的，重組腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA-IRES的具體制備方法如下：

S1.1，核糖體結合位點序列IRES的獲得：根據GenBank數據庫發表的腦心肌炎病毒的核糖體結合位點序列ID:gb|EF591488.1，合成腦心肌炎病毒的核糖體結合位點IRES序列，并在IRES序列的兩端加入酶切位點EcoRI與BamHI，獲得質粒pEx-IRES；