[發明專利]一種免疫原性增強型小反芻獸疫N蛋白基因重組腺病毒的制備方法

在審

• 申請號: 201811258858.2
• 申請日: 2018-10-26
• 公開（公告）號: CN109295013A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 陳靜;王苗利;田夫林;張鶴曉;李佳璇;孫圣福;馬慧玲;張月;孔祥華;藺曉月
• 申請（專利權）人: 山東省動物疫病預防與控制中心
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/861;C12N15/45;C12N15/66;A61K39/155;A61P31/14
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 楊海明

1.一種免疫原性增強型小反芻獸疫N蛋白基因重組腺病毒的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1，將腦心肌炎病毒的核糖體結合位點序列IRES連接到復制缺陷型腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA上,然后提取重組腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA-

IRES；

S2，將含有小反芻獸疫N蛋白的DNA序列和含有結核分枝桿菌Ag85A基因的DNA序列克隆至重組腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA-IRES上，而后提取重組腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA-N-IRES-Ag85A；

S3，將提取得到的重組腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA-N-IRES-Ag85A和復制缺陷型腺病毒pacAd59.2-100骨架DNA經線性化后，轉染真核細胞AD-293，得到重組腺病毒rAd-N-IRES-Ag85A；

S4，將所得到的重組腺病毒rAd-N-IRES-Ag85A經濃縮、純化、擴增，制備得免疫原性增強型小反芻獸疫N蛋白基因重組腺病毒。

2.根據權利要求1所述的免疫原性增強型小反芻獸疫N蛋白基因重組腺病毒的制備方法，其特征在于：所述步驟S2中，小反芻獸疫N蛋白的DNA序列和含有結核分枝桿菌Ag85A基因的DNA序列以共表達的形式克隆至重組腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA-IRES上。

3.根據權利要求1所述的免疫原性增強型小反芻獸疫N蛋白基因重組腺病毒的制備方法，其特征在于：所述步驟S2中，轉染真核細胞AD-293的過程是在脂質體的作用下共同完成的。

4.根據權利要求1所述的免疫原性增強型小反芻獸疫N蛋白基因重組腺病毒的制備方法，其特征在于，重組腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA-IRES的具體制備方法如下：

S1.1，核糖體結合位點序列IRES的獲得：根據GenBank數據庫發表的腦心肌炎病毒的核糖體結合位點序列ID:gb|EF591488.1，合成腦心肌炎病毒的核糖體結合位點IRES序列，并在IRES序列的兩端加入酶切位點EcoRI與BamHI，獲得質粒pEx-IRES；

S1.2，穿梭質粒的改造：分別提取質粒pEx-IRES和pacAd5CMVK-NpA，利用限制性內切酶EcoRI與BamHI分別酶切質粒，經過連接、轉化后獲得改造后的重組腺病毒穿梭質粒pacAd5CMVK-NpA-IRES。