[發(fā)明專(zhuān)利]一種對(duì)胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811258811.6
• 申請(qǐng)日: 2018-10-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109504669B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-06-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚冬生;林香娜;汪浩;謝春芳;劉大嶺
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣東方善能動(dòng)物保健有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/42
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/42;C12N15/56;A23L29/00;A23K20/189
• 代理公司: 深圳紫晴專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 44646
• 代理人: 付欽偉

本發(fā)明公開(kāi)了一種對(duì)胰蛋白酶抗性提高的β?葡萄糖苷酶及其應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)野生型β?葡萄糖苷酶分子內(nèi)的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行了改造，提供了一種獲得對(duì)胰蛋白酶抗性提高的β?葡萄糖苷酶突變體。本發(fā)明所述的作用于纖維二糖和短鏈纖維寡糖的突變體β?葡萄糖苷酶(mBGL1)，對(duì)胰蛋白酶的抗性比野生型BGL1提高2倍以上，半衰期延長(zhǎng)，其他酶學(xué)性質(zhì)與野生型酶基本一致。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及β-葡萄糖苷酶，特別涉及到對(duì)胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶。

背景技術(shù)

β-葡萄糖苷酶(β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21，簡(jiǎn)稱(chēng)BGL1)又稱(chēng)為葡萄糖苷水解酶，它能水解纖維二糖和短鏈纖維寡糖生成葡萄糖，解除纖維二糖和纖維寡糖對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶的反饋抑制，還可以把水果和茶葉中的香氣前體物酶解，起到增強(qiáng)香氣的作用。β-葡萄糖苷酶屬于水解酶類(lèi)，是纖維素酶系的重要組成成分之一。

β-葡萄糖苷酶在人類(lèi)的糖原降解和動(dòng)物、植物、微生物的糖類(lèi)代謝方面具有重要的生理功能。近年來(lái)，其在食品工業(yè)中表現(xiàn)出了重要的應(yīng)用前景：β-葡萄糖苷酶可水解果蔬中的風(fēng)味前體物質(zhì)如單帖烯醇糖苷等，釋放出具有濃郁天然香氣的物質(zhì)，已成為食品工業(yè)中重要的風(fēng)味增香劑。在制備功能性食品時(shí)則用于生物活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，如豆奶中添加β-葡萄糖苷酶或接種產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物,都能夠?qū)⒍鼓碳岸鼓谭壑猩镉行暂^低的異黃酮糖苷化合物高效轉(zhuǎn)化為高活性的異黃酮苷元。β-葡萄糖苷酶的另一重要用途是作用于纖維素生物轉(zhuǎn)化，纖維素這一巨大可再生資源的有效利用對(duì)解決環(huán)境污染、食品短缺、能源危機(jī)具有重大現(xiàn)實(shí)意義。在飼料工業(yè)中,β-葡萄糖苷酶常被作為一種飼料添加劑,它可以酶解富含纖維的細(xì)胞壁,使細(xì)胞內(nèi)包含的蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放出來(lái),同時(shí)又將纖維降解為便于動(dòng)物消化吸收的還原糖,從而提高飼料利用率。但是在實(shí)際應(yīng)用中還是有許多不足,如穩(wěn)定性不夠好等，這會(huì)影響β-葡萄糖苷酶的有效性而增加了應(yīng)用成本。因此對(duì)葡萄糖苷酶進(jìn)行改造具有十分重要的意義。

近十八年來(lái)，有關(guān)β-葡萄糖苷酶的專(zhuān)利有近190個(gè)，這些專(zhuān)利主要集中于發(fā)現(xiàn)和篩選來(lái)自不同來(lái)源的產(chǎn)不同特征的β-葡萄糖苷酶的菌株或通過(guò)基因重組方法獲得產(chǎn)不同特征的β-葡萄糖苷酶的菌株(如所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶具有嗜/耐熱(ZL201610060528.7、ZL201310049606.X、ZL201510203453.9、ZL201510203484.4、ZL201110214130.1)、高溫中性(ZL201410713835.1)、中溫中性(ZL201410717927.7、ZL201110334815.X)、嗜熱堿性(ZL200510116748.9)、嗜熱耐酸性(ZL200910218167.4、ZL201410753327.6、ZL201510460386.9)、酸性(ZL201410718610.5)、嗜溫耐乙醇(ZL201010577713.6、ZL201410235451.3)、高表達(dá)(ZL201010170523.2、ZL201410037538.X、ZL201410037437.2、ZL201010565278.5)、耐高糖(ZL201210540712.3、ZL201210541293.5、ZL201710698739.8、ZL 201710366423.9、ZL201610095165.0、ZL201310224173.7、ZL201010248207.2)、耐糖耐酸(ZL201710839935.2)、高產(chǎn)耐糖耐酸(ZL201710839898.5)、耐高糖耐堿(ZL201410668699.9)、高產(chǎn)嗜溫耐乙醇(ZL201110417104.9)、高活力(ZL201110102978.5)、高催化效率(ZL201610407183.8、ZL201610061066.0、ZL201610060603.X、ZL201610061593.1)、高耐受性(ZL201510175655.7)、持續(xù)高效分泌(ZL201310187648.X、ZL201510626711.4)等特征之一的菌株)，以及篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的方法(ZL201510903621.5、ZL201210127162.2、ZL201710279045.0、ZL201410075528.5、ZL200710114837.9)，β-葡萄糖苷酶純化方法(ZL200710043571.3)，β-葡萄糖苷酶酶活測(cè)定方法(ZL200910096109.9)，β-葡萄糖苷酶固定化方法(ZL201510920113.8、ZL201710579688.7、ZL201710689763.5、ZL201610348992.6、ZL201610899746.X、ZL201310712037.2、ZL201210449928.9、ZL201210052838.6、ZL201110293398.9、ZL200810035950.2、ZL201810109984.5)，β-葡萄糖苷酶制備方法(ZL201710581264.4、ZL201510026295.4、ZL201410510836.6、ZL201110374822.2、ZL200910153807.8、ZL200910092695.X、ZL201810034473.1)，構(gòu)建產(chǎn)β-葡萄糖苷酶基因工程菌方法(ZL201410126924.6、ZL 201410699758.9、ZL201610285023.0、ZL201610838951.5、ZL201510172770.9、ZL201510658194.9、ZL201410801030.2、ZL201410801031.7、ZL201210017857.5、ZL201110221185.5、ZL201110301931.1、ZL201110034926.9、ZL201110132525.7、ZL201110266535.X、ZL200910092527.0、ZL200610025503.X、ZL201110120297.1、ZL200910029055.4、ZL200910159235.4)，及上述所得β-葡萄糖苷酶的編碼基因和應(yīng)用等。通過(guò)檢索中國(guó)學(xué)位論文庫(kù)發(fā)現(xiàn)近年來(lái)有關(guān)β-葡萄糖苷酶酶活性質(zhì)的論文有很多，其中主要集中于通過(guò)基因重組、復(fù)合誘變、改良篩選方法、對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化等方法來(lái)提高其酶活以及熱穩(wěn)定性(Q55 Q785、TQ925、TQ929.2、TQ925 TQ920.1、Q939.9、TS261.11、TQ925、TS201.25 TS201.3、Q814、Q814.1 Q936)、葡萄糖耐受性(Q949.327.103、Q556.2 Q786)催化效率提高(TQ925)、耐熱、耐堿及耐部分金屬離子的特點(diǎn)(Q93-331、S216.2、Q949.327.1Q943.2、TQ925.5、R282.71 Q556.2)等等。而具有胰蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶目前尚未見(jiàn)報(bào)道。