[發明專利]一種用于治療兒童矮小癥的重組人血清白蛋白/生長激素融合蛋白的制備純化方法

有效

• 申請號: 201811258235.5
• 申請日: 2018-10-26
• 公開（公告）號: CN109851674B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發明（設計）人: 侯瓊;楊小楠;陳穎;富巖;于在林
• 申請（專利權）人: 天津林達生物科技有限公司;天津溥瀛生物技術有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/81;C12N1/19;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16;A61K38/27;A61K47/42;A61P5/06;C12R1/84
• 代理公司: 天津市尚儀知識產權代理事務所(普通合伙) 12217
• 代理人: 王山

1.一種用于治療兒童矮小癥的重組人血清白蛋白/生長激素融合蛋白的高密度表達和純化方法，其特征在于，

所述高密度表達方法包括以下步驟：

a.重組人血清白蛋白/生長激素融合蛋白載體質粒的構建及表達：

以人胎肝中提取的總RNA為模板，利用反轉錄多聚酶鏈聚合反應來合成、擴增HSA基因；經電泳分離純化HSA DNA片段 ，將其克隆至酵母表達載體，獲得pYZ-HSA重組質粒；采用DNA全序列合成法來人工合成GH核苷酸序列；酶切合成的目的基因GH和pYZ-HSA重組質粒，并將二者進行連接，獲得pYZ-HSA/GH重組質粒；

其中，所述重組人血清白蛋白/生長激素融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:1所示，編碼核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

b.畢赤酵母表達工程菌的轉化和制備

將pYZ-HSA/GH重組質粒經Pme I限制性內切酶處理后電轉入畢氏酵母X33感受態細胞，轉化后的酵母菌接種于含Zeocin抗生素的YPD平板培養基上進行培養；

c.重組酵母工程菌的篩選

將數個含有待表達基因的酵母菌落分別在含有Zeocin抗生素，具有緩沖能力及甘油的基本培養液中培養；培養一段時候后離心收集菌體，菌體再重懸于不含甘油的同種基本培養液內，含0.5％甲醇；每24小時加入100％甲醇至最終濃度為0.5％，在不同的時間點分別收集培養上清液，篩選表達特異蛋白的重組酵母工程菌株；

d.大規模高密度表達rHSA/GH融合蛋白

使用500L或1000L生物發酵罐系統，取一支工程菌種子庫，小規模搖床培養開始，然后擴增到一級種子罐、二級種子罐，進入生產發酵罐；經培養至罐內甘油消耗盡，溶氧隨之回至底限再回升時，啟動甘油流加；待流加結束，溶氧再回升時，啟動甲醇流加，進入誘導和重組蛋白生產階段，維持72小時甲醇流加；

將高密度表達獲得的重組人血清白蛋白/生長激素融合蛋白進行純化包括如下步驟：

a.初純親和層析柱：Capto-MMC

平衡緩沖液：30mM NaAc-HAc，10mM半胱氨酸，5％甘氨酸，pH5.5洗雜緩沖液：20mM PB，10mM半胱氨酸，5％甘氨酸，pH6.5

洗脫緩沖液：20mM PB,10mM半胱氨酸，5％甘氨酸，1.0M NH4ClpH7.5；

b.疏水介質層析柱：Phenyl Sepharose^TM High Performance

平衡緩沖液：20mM PB，10mM半胱氨酸，5％甘氨酸，1.3M NH4Cl，pH6.7

洗脫緩沖液：20mM PB，pH6.7；

c.離子純化分離層析柱：Q Sepharose^TM Fast Flow

平衡緩沖液：20mM PB，10mM半胱氨酸，5％甘氨酸，pH7.2

洗雜緩沖液：20mM PB，180mM NaCl，10mM半胱氨酸，5％甘氨酸，pH7.2

洗脫緩沖液：20mM PB，800mM NaCl，10mM半胱氨酸，5％甘氨酸，pH7.2；

d.層析柱：Sephacryl S-200HR

平衡緩沖液：20mM PB，5％甘氨酸，pH7.2。