[發明專利]永生化的犬脂肪間充質干細胞的體外培養方法及其用途

在審

• 申請號: 201811247807.X
• 申請日: 2018-10-25
• 公開（公告）號: CN109321521A
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 華進聯;方佳;滕鑫;溫新宇;晏原
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61L27/38;A61L27/60
• 代理公司: 西安新思維專利商標事務所有限公司 61114
• 代理人: 韓翎

1.永生化的犬脂肪間充質干細胞在治療犬皮膚缺損中的應用。

2.如權利要求1所述的永生化的犬脂肪間充質干細胞的體外培養方法，其特征在于：包括以下步驟：

1）永生化的犬脂肪間充質干細胞的復蘇：

于液氮中取出凍存的永生化的犬脂肪間充質干細胞置于37℃的水浴鍋中迅速解凍，將解凍的細胞加入10倍體積的α-MEM完全培養液中1000 rpm，5 min 常溫離心，棄去離心上清，加入α-MEM完全培養液混勻，轉移置細胞培養皿中，置于37℃、體積比為5% CO₂的培養箱中貼壁培養，待4-6 h后細胞貼壁，換入新鮮α-MEM完全培養液培養至細胞90% 融合時進行消化傳代；

2）永生化的犬脂肪間充質干細胞的傳代：

傳代時將細胞培養液上清吸出，換入1mL PBS輕柔浸潤細胞后棄去PBS，加入500 μL0.25%胰蛋白酶，置于37℃、體積比為5% CO₂的培養箱中孵育，待細胞回縮至近圓形，加入1mL α-MEM完全培養液中和消化，1000 rpm，常溫離心5 min，棄去離心上清，加入6 mL α-MEM完全培養液混勻，按1:3比例傳代至3個60 mm細胞培養皿中，每兩天換液一次。

3.如權利要求2所述的永生化的犬脂肪間充質干細胞的體外培養方法，其特征在于：所述的步驟1）的α-MEM完全培養液為α-MEM加入10% FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、100 mg/mL青霉素/鏈霉素。

4.如權利要求3所述的永生化的犬脂肪間充質干細胞的體外培養方法，其特征在于：所述的步驟2）的PBS為8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.899 g Na₂HPO₄·12H₂O、0.2 g KH₂PO₄溶于1000 mL四蒸水中，高壓滅菌后降至室溫分裝備用。