[發(fā)明專利]一種巴西曲霉用于卷煙防霉劑抑菌效果指示菌的用途及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811245974.0
• 申請日: 2018-10-24
• 公開（公告）號: CN109295157A
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 雷聲;楊乾栩;師艷萍;蔣舉興;劉秀明;段焰青;張玲;張曉鳴;夏書芹;陳文怡
• 申請（專利權(quán)）人: 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12R1/66
• 代理公司: 北京市領(lǐng)專知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11590
• 代理人: 陳有業(yè);任文娟

本發(fā)明公開了一種巴西曲霉作為卷煙防霉劑抑菌效果指示菌的用途及方法，所述巴西曲霉指示菌ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株編號為16404。巴西曲霉作為卷煙防霉劑抑菌效果指示菌的方法，包括如下步驟：(1)活化巴西曲霉；(2)培養(yǎng)巴西曲霉；(3)制備巴西曲霉孢子懸液；(4)制備含菌平板；(5)放置無菌牛津杯；(6)制備防霉劑稀釋液；(7)牛津杯中加入防霉劑；(8)培養(yǎng)實驗組和對照組；(9)以十字交叉法測量抑菌圈直徑，記錄數(shù)據(jù)；(10)根據(jù)抑菌圈平均直徑劃分敏感度。本發(fā)明的方法解決了卷煙防霉劑抑菌效果指示菌的篩選繁瑣、可能存在安全隱患的問題，具有培養(yǎng)周期短、安全性高、代表性強及準(zhǔn)確性高等優(yōu)點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種巴西曲霉用于卷煙防霉劑抑菌效果指示菌的用途及方法。

背景技術(shù)

我國是世界上第一煙葉生產(chǎn)大國，產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的三分之一。煙草行業(yè)是我國產(chǎn)業(yè)中難以被替代的支柱性產(chǎn)業(yè)之一，也是國家財政收入的重要來源之一。伴隨著我國卷煙工業(yè)企業(yè)聯(lián)合重組的加快和結(jié)構(gòu)持續(xù)提升的良好態(tài)勢，卷煙工業(yè)企業(yè)對優(yōu)質(zhì)煙草的需求更加迫切。但是在卷煙銷售及貯藏過程中，受環(huán)境濕度的影響，容易發(fā)生霉變現(xiàn)象，從而導(dǎo)致卷煙質(zhì)量降低甚至報廢。因此，防治煙草霉變是卷煙綜合治理的重要內(nèi)容，卷煙防霉劑的研發(fā)也是提高卷煙品質(zhì)所需的重要環(huán)節(jié)。在研制卷煙防霉劑的過程中，需要一種能夠準(zhǔn)確評價防霉劑對卷煙霉菌抑制效果的指示菌，以研制出具有針對性的新型高效卷煙防霉劑，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的廣譜抑菌性化學(xué)防霉劑。所述的指示菌應(yīng)同時具有安全性高、指示作用好、培養(yǎng)周期短、易于實驗操作等特點。

目前防霉劑研發(fā)過程中使用的指示菌，多為包含多個屬的霉變微生物或其混合菌，如含有曲霉屬、青霉屬、毛霉屬、根霉屬等的孢子懸液或混合孢子懸液。此類方法需從霉變卷煙中篩選分離得到多株霉變微生物，但分離過程耗時費力，且制作孢子懸液時容易出現(xiàn)操作誤差，不同屬間難以比較，不易于控制變量，影響實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。此外，有文獻將黃曲霉等單株真菌作為防霉劑抑菌效果指示菌，但大多真菌的代謝產(chǎn)物為真菌毒素如黃曲霉毒素等，可能具有致癌、致畸和致突變作用，在實驗操作中大量接觸嚴(yán)重威脅實驗人員的健康和環(huán)境安全。上述指示菌都不適合用于卷煙防霉劑抑菌效果指示菌的用途。因此迫切需要一種高效、安全、代表性強和準(zhǔn)確性高的卷煙防霉劑抑菌效果指示菌。

為解決上述問題，提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)是與黑曲霉(Aspergillus niger)高同源性的近親菌株，雖然目前尚未有大量研究報道，但其近親菌株黑曲霉是被美國FDA認(rèn)證的安全菌種(GRAS)，黑曲霉因其不產(chǎn)生毒素、培養(yǎng)周期短，常作為發(fā)酵菌株用于制作醬料、醬油和米酒等。

本發(fā)明通過測定15種卷煙霉變微生物的致霉性，篩選出卷煙致霉性最強的一株菌株巴西曲霉，將其用作卷煙防霉劑抑菌效果的指示菌。方法為：通過設(shè)計一種模擬卷煙成分營養(yǎng)環(huán)境的模型培養(yǎng)基，測定每株霉變微生物的卷煙致霉性，篩選出致霉性最為突出的一株霉變微生物巴西曲霉作為卷煙防霉劑抑菌效果的指示菌。通過測定某一濃度下的防霉劑對巴西曲霉指示菌孢子懸液的抑菌效果、以及該相同濃度下的防霉劑對15種卷煙霉變微生物孢子懸液的抑菌效果。結(jié)果證明，巴西曲霉的致霉性最強，并且具有其他卷煙霉變微生物相似的受抑制特性，可以用于卷煙防霉劑抑菌效果的指示菌。通過18SrDNA-ITS序列測定得知，所用巴西曲霉與ATCC16404標(biāo)準(zhǔn)菌株為同種菌株，在研制新型卷煙防霉劑過程中，可以直接商購ATCC16404標(biāo)準(zhǔn)菌株巴西曲霉用作卷煙防霉劑抑菌效果的指示菌，解決了目前卷煙防霉劑抑菌效果指示菌的篩選繁瑣、可能存在安全隱患的問題。

本發(fā)明將巴西曲霉用于卷煙防霉劑抑菌效果指示菌的用途，具體方法為采用牛津杯法測定卷煙防霉劑抑菌圈以評價其抑菌效果。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明第一方面公開了一種巴西曲霉作為卷煙防霉劑抑菌效果指示菌的用途，所述巴西曲霉指示菌ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株編號為16404。